En Multi-hål cryovial Eliminerar Frysning Artefakter när Muscle Vävnader Direkt Nedsänkt i flytande kväve
Summary
Detta protokoll beskriver ett förfarande för att frysa muskelvävnad genom att störta dem direkt i flytande kväve. Detta protokoll belyser också en ny cryovial som kan undvika "filt-effekten" av kvävgas när flytande kväve i kontakt med vävnadsytan av ett prov.
Abstract
Studier av skelettmuskelfysiologi möta den tekniska utmaningen att på lämpligt sätt bearbeta prover för att erhålla sektioner med tydliga cytoplasmiska fack. Ett annat hinder är den snäva apposition av myofibrer till de omgivande vävnaderna. Därför att processen med vävnadsfixering och paraffininbäddning leder till krympning av muskelfibrer, är frysning en optimal medel för härdning muskelvävnad för snittning. Men en vanligt förekommande problem, bildandet av iskristaller sker under beredningen av frysta snitt på grund av den höga vattenhalten i muskeln. Protokollet presenteras här först beskriver en enkel och effektiv metod för att korrekt frysning muskelvävnad genom nedsänkning dem i flytande kväve. Problemet med att använda flytande kväve ensamt är att den ger upphov till bildning av en kväve gasbarriär intill vävnaden, som fungerar som en isolator och hämmar kylningen av vävnaderna. För att undvika detta "ånga filt" -effekt, en new cryovial var utformad för att öka hastigheten på vätskeflödet runt vävnadsytan. Detta uppnåddes genom att stansa totalt 14 inloppshål i väggen av flaskan. Enligt bubbla dynamik, till en högre frekvens av vätskeflödesresulterar i mindre bubblor och färre chanser bilda en gasbarriär. När flytande kväve strömmar in i köldkärlet genom inloppshålen, är flödeshastigheten runt vävnaden tillräckligt snabbt för att eliminera gasbarriär. Jämfört med metoden för frysning muskelvävnad med användning pre-kyld isopentan, är detta protokoll enklare och mer effektiv och kan användas för att frysa muskel i en genomströmning sätt. Dessutom är denna metod optimalt för institutioner som inte har tillgång till isopentan, som är extremt brandfarlig vid rumstemperatur.
Introduction
Skelettmuskel är den mest värdefulla komponenten av en köttproducerande djuret från den näringsmässiga och bearbetningssynpunkt. I köttindustrin, finns det två särskilt kritiska aspekter: effektiviteten i muskeltillväxt och kvaliteten på den resulterande köttet. Som en huvudkomponent av muskeln, muskelfibrer är direkt relaterad till tillväxten och färskt köttkvalitet i djur 1. Till exempel, det totala antalet fibrer (TNF) och korset sektionsarean hos fibrer (CSAF) mestadels bestämma muskelmassa och köttkvalitet; också, Fibertyp Komposition (FTC) påverkar starkt färskt kött kvalitet 2. Därför är manipulation av muskelfiberegenskaper hos djur en mycket effektiv metod för att öka kärnan lönsamhet och konkurrenskraft av gårdar 1.
Hittills har flera inre och yttre faktorer som har identifierats för att manipulera muskelfibrer characteristics 1. Denna manipulation kan uppnås genom den riktade urvalet av djur med specifika gener, såsom den Myostatin genen hos nötkreatur 3, den Callipyge genen hos får 4, och RYR1 och IGF2-generna hos svin 5. Även kost kontroll och behandlingar med specifika hormoner spelar en viktig roll i muskelfiberegenskaper 6. Således kan en strategi som kombinerar genetiska och näringsfaktorer kunna förbättra magert kött innehåll och köttkvalitet. Men studier av muskelfibrer begränsad inom köttindustrin eftersom klarlägga struktur av muskelfibrer är fortfarande en utmaning.
Muskelfiberegenskaper identifieras med användning histokemiska metoder, såsom myosin adenosintrifosfatas (ATPas) -analys. Denna metod förlitar sig på det faktum att enzymer lokaliserade i tunna (6-8 pm) frysta sektioner avmuskelfibrer kan kemiskt reagera med vissa produkter. Emellertid är vattenhalten i musklerna större än 75% hos grisar, kaniner, möss och människor, oberoende av positionen (dvs rygg, buk, eller bakdelen) 7. Sådan hög fukthalt i muskler orsakar ett vanligt förekommande problem – frysning artefakter – under framställningen av kryosektioner, som tidigare beskrivits 8, 9. I de flesta fall är det nästan omöjligt att på lämpligt sätt frysa muskler i ett slakteri produktionslinje, enligt vår erfarenhet.
Det protokoll som presenteras här beskriver en enkel och effektiv metod som används i vårt laboratorium för att frysa muskelvävnad för cryosectioning i en hög genomströmning sätt. Höjdpunkten i denna metod är en ny cryovial som är avsedd för flash-frysning muskelvävnad i flytande kväve. Den aktuella arbetsflödet kan samtidigt underlätta vävnadfrysning och bearbetning för en utmärkt muskel kryosnitt, med en klart synlig cytoplasmisk avdelning och den snäva apposition av myofibrer till den omgivande vävnaden. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på ett brett spektrum av alternativ för vävnadsanalys eftersom flytande kväve inte blandar med vävnader.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en ny multi hål cryovial för frysning och lagring muskelvävnad att utföra histologiska bedömningar av muskelfunktion. Det kritiska modifierade steget i detta protokoll är att provet i det med flera hål cryovial är direkt nedsänkt i flytande kväve. Såvitt vi vet är detta det enklaste och rapidest sätt att få utmärkta frysta prover för muskel cryosectioning bland de befintliga frysmetoder (se representativa resultat).
Den tekniska utmaningen genom muskelforska…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projektet stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC): 31.301.950 och 31.671.288.
Materials
| Cryostat Microtome | Leica | Leica CM1950 | |
| Digital Microscope | Nikon | Nikon DS-U3 | |
| Cryogenic Vial Plastic film | Designed by ourself | ||
| Liquid Nitrogen | Commomly-used | ||
| Scalpel | Commomly-used | ||
| 10cm-forcep | Commomly-used | ||
| 25cm-tweezer | Commomly-used | ||
| Safety glass | Commomly-used | ||
| Freezer gloves | Commomly-used |
References
- Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
- Lefaucheur, L. A second look into fibre typing–relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
- Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
- Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).
- Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
- Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
- Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793 (2015).
- Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
- Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
- Dubowitz, V., Sewry, C. . Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).
- Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
- Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
- Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).
