موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات
Summary
ويصف هذا البروتوكول تقنية موسع لأخذ عينات السوائل البطانة المخاطية دون عائق من الخطوط الجوية العليا. ويمكن استخدامه لإجراء التقدير الكمي في فيفو مستويات البروتين الوسطاء، مثل السيتوكينات والمستقطبات، في موضوعات في جميع الإعمار.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول موسع لأخذ العينات من مجرى الهواء العلوي دون عائق البطانة المخاطية السائل. أنها أيضا تفاصيل إجراءات استخراج المستخدمة قبل تحليل الوسطاء محصنة في السوائل الواتس لدراسة التوقيع المناعية الموضعية مجرى الهواء، دون الحاجة لإجراءات التحفيز (غالباً ما تستخدم بتقنيات أخرى). يتم أخذ عينات السوائل البطانة المخاطية على شريط من ورق الترشيح وضعت في الجزء الأمامي من أدنى توربيناتي وتترك لمدة 2 دقيقة للاستيعاب. تحليلها هي التيد من أوراق التصفية، ويتم تحليل الواتس على أساس البروتين المستخرج من المناعة المستندة إلى اليكتروتشيميلومينيسسينسي، مما يسمح لحساسية عالية التحديد الكمي لتحليلها منخفضة ورفيع المستوى في نفس العينة. قمنا بقياس المستويات في فيفو 20 الوسطاء المناعية المختارة المتعلقة بالمناعة محددة مما يشير إلى مسارات في الغشاء المخاطي مجرى الهواء العلوي، ولكن هذا الأسلوب لا يقتصر على ذلك لوحة محددة أو موقع أخذ العينات. الأسلوب الذي نفذ أولاً في الأطفال عمرها 7 سنوات من “الدراسات المستقبلية” كوبنهاغن على الربو في الطفولةعام 2000 (كوبساك2000) الفوج مع حساسية الآنف. وبعد ذلك استخدامه في كوبساك طولية2010 الولادي، عينات في الشهر 1، 2 سنة، و 6 سنوات من العمر، وفي حالات من الأعراض التنفسية الحادة. نحن التي تم الحصول عليها بنجاح، وتحليل عينات من 620 (89 في المائة) من 700 1 شهرا الأطفال؛ وكانت عينات قليلة أقل من حد الكشف والرزن (ذكرت كالوسيط (ربعي بين مجموعة (IQR)). وكان العدد العينات الكشف عن الحد الأدنى (أي من 0 إلى النقطة المحددة للحد الأدنى للكشف) لكل وسيط 29 (7.25-119.5). هذا الأسلوب يتيح التحديد الكمي للشخصية فيفو في المناعة المخاطية مجرى الهواء من الولادة ويمكن تطبيقها طوليا، ويمكن تطبيقها على دراسات بشأن تأثير الوراثة والتعرض البيئي المبكر الحياة والفيزيولوجيا المرضية، اندوتيبينج، ورصد أمراض الجهاز التنفسي، وتطوير وتقييم للمداواة الرواية.
Introduction
يجعل السائل البطانة المخاطية للأنف حتى الجزء السائل من النظام مجرى الهواء العلوي. وهو يتألف من مصفوفة معقدة من الوسطاء المستمدة من التفاعل بين ظهارة والخلايا المناعية التي تشكل الخط الأول للدفاع ضد غزو الكائنات الحية الدقيقة. الغشاء المخاطي للأنف يتم الوصول إليها بسهولة، وهناك علاقة وظيفية ومناعية قوية بين الآنف و القصبات الهوائية1. هذه المقصورة باهتمام خاص فيما يتعلق بمجرى الهواء من الأمراض الشائعة في الطفولة، مثل الربو وحساسية الآنف، ولكن أيضا إلى مجموعة من اضطرابات الجهاز التنفسي الأخرى أكثر انتشارا في وقت لاحق في الحياة.
وهنا يصف لنا تنفيذ أسلوب بعينه دون عائق المخاطية بطانة السائل من تجويف الآنف باستخدام تقنية التصفية الورقية، noninvasive، فضلا عن إجراءات استخراج لاحقة، تستخدم الوتي تحليلها على أساس البروتين من أوراق التصفية قبل كمياً. يمكن، على سبيل المثال، استخدام هذا الأسلوب للحصول على توقيعات محصنة ضد كل من الأشخاص الأصحاء والأفراد بمختلف أمراض الجهاز التنفسي في فيفو . وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لدراسة حالات التعرض لأهمية لتوقيع المناعي محدد وتقييم إذا كان التوقع أو الوسيط لتطور المرض لاحق.
سائل البطانة المخاطية حصلت سابقا بالغسل الآنف2، الذي هو غالباً ما يسبقه اختبار تحدي الآنف، حيث أدخلت حساسية في المستويات العالية الحث استجابة التهابية3،4. ومع ذلك، تقنية الغسل الآنف ليس ممكناً في الأطفال الصغار ويدخل عامل إضعاف غير معروف، مما يفند النتائج، كوسيط المخفف يمكن أن تنخفض مستويات أقل من حد الكشف والرزن5. وعلاوة على ذلك، نظراً لعامل إضعاف غير معروف، ردود مدروسة أكثر من اختبارات التحدي الآنف ليست قابلة للمقارنة بين الأفراد، مما يحد من جدوى تقنية الغسل الآنف في مجموعة الإعداد. وأخيراً، التحدي حساسية لا ينطبق إلا في مواضيع توعية، والتحديات الأخرى، مثل الهستامين والتحدي، ليست فسيولوجيا ذات الصلة، يحتمل أن تسبب أثرا سقف على الإفراج عن الوسيط. يتم الالتفاف على هذه المشاكل في تقنية التصفية الورقية المقدمة لجمع السائل البطانة المخاطية، حيث يتم إفراز الفردية من السوائل ومستويات أكثر العوامل الوحيدة التي تؤثر على الفرق بين الفرد.
أثناء عملية الاستخراج، التيد تحليلها هي لجميع عينات من أوراق التصفية بعد إضافة كميات متماثلة من المخزن المؤقت. وهذا تفضل مماثلة السابقين فيفو تمييع جميع العينات. يتم استخدام مخزن مؤقت لاستخراج الحل الملح متساوي التوتر القائم على الزلال لخطوة الاستخراج؛ فهو يمكن استخراج الوسطاء القائم على البروتين وتستقر البروتينات إلى الحد من تمسخ أثناء تجميد اللاحقة من البروتينات الوتيد قبل التحديد الكمي. لتجنب تدهور البروتين خلال مرحلة الاستخراج، يتم إضافة خليط مثبطات البروتياز إلى المخزن المؤقت الاستخراج.
تنفيذ التقنيات التي تسمح للتقدير الكمي من دون عائق، في فيفو-الوسطاء المناعية التي تم إنشاؤها في مواقع المخاطية من الأهمية بمكان. أولاً، تشكل الموقع المخاطية أكبر جهاز المناعة في الجسم. ثانيا، موقع الآنف هو الموقع الرئيسي للتعرض المحمولة جوا وأحكام متصلة إلى حجرة المناعية التنفسية ل الرئتين1. ثالثا، يفتح إمكانية مسح هذا الجهاز الهام مع تقنية موسع في إمكانية توفير عدد كبير معلومات على محور التفاعل المناعي ميكروب هامة فيما يتعلق بالصحة والمرض في الخطوط الجوية. رابعا، هناك العديد من التطبيقات الممكنة الأخرى لهذه التقنية، مثل دراسة التعديلات المناعية المحلية في تجارب معشاة ذات شواهد، رقابة الأدوية والمغذيات الدقيقة.
في البداية نفذنا التقنية في “الدراسات المستقبلية” كوبنهاغن على الربو في الطفولة فوج2000 (كوبساك2000)، حيث عقدنا العزم الشخصية محصنة من السوائل البطانة المخاطية لدى الأطفال عمرها 7 سنوات مع حساسية الآنف مقابل ضوابط صحية13. فيما بعد، نحن طبقت بنجاح هذا الأسلوب إلى الفوج2010 كوبساك الطولي والملامح المناعية مجرى الهواء المقررة في شهر 1, 2 سنة، و 6 سنوات من العمر، وفي حالات من الأعراض التنفسية الحادة. أظهرت نتائج من الولدان 1 أشهر الجمعيات الهامة بين توقيع المناعي والتعرض البيئي المبكر الحياة7،،من89،10،11،12.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع تقنية المعروضة هنا، كنا قادرين على تحديد في فيفو مجرى الهواء العلوي المخاطية المناعي التشكيل الجانبي في الأطفال من أقرب شهر واحد من العمر، والتي لم يتم مسبقاً. ولاحظنا أن وجود البكتيريا مجرى الهواء محددة وبيكورنافيروسيس7،11، فضلا عن أخرى من قبل والت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعرب عن امتناننا للأطفال والأسر دراسة الأتراب كوبساك2010 لجميع الدعم والالتزام. نحن نعترف ونقدر جهود فريق البحث كوبساك ومساعدة تقنية من فني ليزبيث بووس روشولم، “جامعة الدنمارك التقنية”، لقياس السيتوكينات والمستقطبات فريدة من نوعها.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
