体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング
Summary
このプロトコルでは、上気道から邪魔されず粘膜被覆液のサンプリングのための非侵襲的技術について説明します。それは、すべての年齢層の被験者でタンパク質メディエーター、サイトカイン、ケモカインなどの生体内レベルの定量化を実行する使用できます。
Abstract
このプロトコルでは、妨げられていない上部気道粘膜内層流体の非侵襲的サンプリングについて説明します。それはまた刺激プロシージャ (よく、他の技術によって使用される) を必要とせず、気道局所の免疫署名に関する流体波における免疫メディエーターの分析の前に使用される抽出手順の詳細します。フィルター ペーパーのストリップの粘膜内層液をサンプリング下鼻甲介と吸収の 2 分間左の前部で置かれました。検体用濾紙から溶出され、同じサンプルの低レベルと高レベル分析の高感度定量を可能にする、電気化学発光を用いたイムノアッセイ法によって抽出された蛋白質基づいた溶出を分析します。上部気道粘膜における情報伝達システム特定の免疫に関連する 20 あらかじめ免疫メディエーターの体内レベルを測定したが、技術はその特定のパネルまたはサンプリング サイトに制限されていません。技術は、アレルギー性鼻炎小児2000 (COPSAC2000) コホート研究における喘息のコペンハーゲンの前向き研究から 7 歳児に最初実装されました。それはその後 1 ヶ月、2 歳、6 歳、急性呼吸器症状のインスタンスをサンプリング、縦の COPSAC2010出生コホートで使用されました。いくつかのサンプル (中央 (四分範囲 (IQR)) として報告測定検出限界以下であった我々 は正常に取得し 700 1 か月児の 620 (89%) からサンプルを分析した; します。各調停の (すなわち0 から検出下限値の設定ポイント) の検出限界以下のサンプル数は、29 (7.25 119.5) だった。この技術は、誕生からin vivo気道粘膜免疫プロファイルの数量化できる、縦、適用することができます、遺伝学と初期の生活環境暴露、病態、endotyping、および呼吸器疾患と開発と新規治療薬の評価の監視の影響に関する研究に適用することができます。
Introduction
鼻の粘膜内層液上部気道系の液体の一部を占めています。調停に由来する上皮および侵入の微生物に対する防御の最初の行を構成する免疫細胞間の相互作用の複雑なマトリックスで構成されています。鼻の粘膜は簡単にアクセスできる、鼻と気管支1の免疫学的機能の強い関係があります。この区画は幼年期、生命に後でより普及しているその他の呼吸器系疾患の範囲にも喘息やアレルギー性鼻炎などでは一般的な気道疾患に関連して特別な関心。
ここでは、サンプル邪魔されず鼻腔から流体をライニング粘膜フィルター紙ベース、非侵襲的手法としてそれに続く抽出プロシージャを使用して、その定量化する前にフィルター ペーパーからの検体の蛋白質ベースの溶出に使用するメソッドの実装について述べる.この手法は、生体内で健康な個人と様々 な呼吸器疾患を持つ個人の免疫の署名を取得するたとえば、使用できます。さらに、特定免疫署名の重要性の露出を確認し、予測または発病後の調停の場合を評価することが可能です。
粘膜内層液は、鼻洗浄2がよく付いている鼻チャレンジ テスト、炎症性応答3,4を刺激するために高いレベルでのアレルゲンが導入される以前受けた。ただし、鼻洗浄技術は、幼児に適さないことがし、5アッセイの検出限界値以下のレベルが落ちることができる希薄化後の調停者として、結果を混同する不明な希釈率を紹介します。また、不明な希釈倍率により鼻チャレンジ テストから測定試料応答が設定コホートで鼻洗浄法の有用性を制限すること、個人間に匹敵します。最後に、アレルゲンの挑戦は、鋭敏化の分野で適用されるだけ、ヒスタミンの挑戦など、その他の課題は生理学的関連性の高い、メディエーター遊離の天井の効果を引き起こす可能性がありますありません。これらの問題は、流体と検体レベルの個々 の分泌が個体間の差異に影響を与える唯一の要因を粘膜内層流体コレクションの紹介したフィルター紙ベース テクニックで回避します。
抽出中に、検体は、すべてのサンプルに、バッファーの同じボリュームの付加の後でフィルター ペーパーから溶出されます。これは、すべてのサンプルの希釈前のヴィヴォ同様優先されます。抽出手順にアルブミン ベース等張食塩水の抽出バッファーを使用します。蛋白質ベースのメディエーターの抽出と定量化の前に溶出蛋白質の以降凍結変性を抑えるタンパク質を安定できます。抽出段階でのタンパク質分解を避けるためには、プロテアーゼ阻害剤のカクテルは抽出バッファーに追加されます。
邪魔されない生体内での定量化を可能にする技術の実装-粘膜のサイトで生成された免疫メディエーターが非常に重要です。最初に、粘膜のサイトは体内最大の免疫臓器をなります。第二に、鼻の位置の気中暴露のプライマリ サイトで、肺1呼吸器免疫学的区画にしっかりと接続されています。第三に、非侵襲的手法でこの重要な器官の調査の可能性は健康と気道の病気に関連して重要な微生物免疫の相互作用軸情報の茄多を提供する可能性を開きます。第四に、この技術は、医薬品と栄養素のランダム化された、制御された試験のローカル免疫学的変化などの他の多くの可能なアプリケーションがあります。
喘息のコペンハーゲンの前向き研究の手法を実装されて最初幼年期2000 (COPSAC2000) コホート研究において、7 歳児健常者13対アレルギー性鼻炎の粘膜内層液の免疫のプロフィールを調べた。その後、我々 は正常に縦 COPSAC2010コホートと評価気道免疫プロファイルにこの手法を適用 1 ヶ月、2 歳、6 歳の時、急性呼吸器症状のインスタンスで。1 歳 1 か月の新生児からの結果は、免疫の署名と初期の生活環境暴露7,8,9,10、11,12間の重要な関連を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで示した手法、体内上部気道粘膜免疫プロファイル以前行われていない時代の 1 ヶ月という早い時期から子供を決定することができました。気道細菌がその存在や周産期曝露と同様、ピコルナ ウイルス7,11, pre が新生児の気道の免疫プロファイルにミラー化されたを見ました。さらに、我々 は高用量ビタミン d の微量栄養素の無作為化?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
子どもと家族の COPSAC2010のコホート研究にすべての彼らのサポートとコミットメントに感謝の意を申し上げます。認識し、COPSAC 研究チームとサイトカインとケモカインの測定技術者 Lisbeth Buus Rosholm、デンマーク工科大学から技術の助けのユニークな努力に感謝します。
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
