Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures
Summary
Ce protocole décrit une technique non invasive pour l’échantillonnage des liquides de muqueuse intacte les voies aériennes supérieures. Il peut être utilisé pour effectuer la quantification des niveaux de in vivo des médiateurs de protéines, tels que les cytokines et chimiokines, chez les sujets de tous âges.
Abstract
Ce protocole décrit non invasive d’échantillonnage du fluide de muqueuse des voies respiratoires supérieures non perturbée. Il détaille également la procédure d’extraction utilisée avant l’analyse des médiateurs immunitaires dans les éluats fluides pour l’étude de la signature immunitaire topique des voies aériennes, sans le besoin de procédures de stimulation (souvent utilisé par d’autres techniques). Le fluide de la muqueuse est échantillonné sur une bande de papier filtre placé à la partie antérieure de l’inférieure cornet et est parti pour 2 min de l’absorption. Analytes sont élués des papiers filtre, et les éluats basées sur les protéines extraites sont analysées par un test immunologique electrochemiluminescence-basé, permettant la quantification ultrasensible d’analytes faible – et de haut niveau dans le même échantillon. Nous avons mesuré les concentrations en vivo de 20 présélectionnés médiateurs immunitaires associés à immunitaire spécifique dans la muqueuse des voies respiratoires supérieures, les voies de signalisation, mais la technique n’est pas limitée à ce panneau spécifique ou un site d’échantillonnage. La technique a été tout d’abord mis en œuvre chez les enfants de 7 ans depuis les études prospectives de Copenhague sur l’asthme dans la cohorte2000 (COPSAC2000) l’enfance avec la rhinite allergique. Par la suite, il a été utilisé dans la cohorte naissance de2010 COPSAC longitudinale, échantillonnée à 1 mois, 2 ans et 6 ans et en cas de symptômes respiratoires aigus. Avec succès, nous avons obtenu et analysé des échantillons de 620 (89 %) de 700 enfants de 1 mois ; quelques échantillons étaient inférieures au seuil de détection du test (signalé comme la médiane (interquartile Range (IQR)). Le nombre d’échantillons inférieures à la limite de détection (c’est-à-dire de 0 à la valeur de consigne pour la limite inférieure de détection) pour chaque médiateur avait 29 (7.25-119,5). Cette technique permet la quantification du profil immunitaire muqueux in vivo des voies respiratoires dès la naissance, peut être appliquée longitudinalement et peut être appliquée à des études sur l’effet de la génétique et début de la vie expositions environnementales, physiopathologie, endotyping et surveillance des maladies respiratoires, de développement et évaluation de nouvelles thérapeutiques.
Introduction
Le fluide de la muqueuse du nez constitue la partie liquide du système supérieur-des voies respiratoires. Il se compose d’une matrice complexe de médiateurs dérivés de l’interaction entre l’épithélium et les cellules immunitaires qui constituent la première ligne de défense contre l’invasion des micro-organismes. La muqueuse nasale est facilement accessible, et il y a une forte relation fonctionnelle et immunologique entre le nez et les bronches1. Ce compartiment est d’un intérêt particulier en ce qui concerne les maladies des voies respiratoires qui sont fréquentes dans l’enfance, comme l’asthme et la rhinite allergique, mais aussi à un éventail d’autres troubles respiratoires plus fréquents plus tard dans la vie.
Nous décrivons ici la mise en œuvre d’une méthode pour échantillons non remaniés muqueuse tapissant le fluide de la cavité nasale à l’aide d’une technique non invasive, axée sur le papier filtre, mais aussi une procédure d’extraction ultérieure, utilisé pour éluer les analytes basées sur les protéines des papiers filtre avant leur quantification. Cette technique, par exemple, permet d’obtenir en vivo signatures immunitaires des individus sains et des individus souffrant de diverses maladies respiratoires. En outre, il est possible d’examiner les expositions d’importance pour une signature immunitaire spécifique et d’évaluer si c’est un facteur prédictif ou le médiateur du développement ultérieur de la maladie.
Muqueuse liquide a déjà été obtenu par lavage nasal2, qui est souvent précédée d’un test de provocation nasale, où un allergène est introduit dans des niveaux élevés pour stimuler une réponse inflammatoire3,4. Cependant, la technique de lavage nasal n’est pas réalisable chez le jeune enfant et introduit un facteur de dilution inconnu, qui confond les résultats, comme le médiateur dilué niveaux peuvent tomber au-dessous de la limite de détection du test5. En outre, à cause du facteur de dilution inconnu, les réponses de l’analyte mesurée depuis les tests de provocation nasale ne sont pas comparables entre les individus, ce qui limite l’utilité de la technique de lavage nasal dans une cohorte de réglage. Enfin, défi de l’allergène n’est applicable chez les sujets sensibilisés et autres défis, comme le défi de l’histamine, ne sont pas physiologiquement pertinents pouvant causer un effet de plafond sur la libération de médiateurs. Ces problèmes sont contournés dans la technique de sur filtre papier présentée d’accumulation de liquide muqueuse, où la sécrétion individuelle des fluides et des niveaux de l’analyte sont les seuls facteurs qui influencent la variation inter-individuelle.
Au cours de la procédure d’extraction, analytes sont éluées des papiers filtre après l’ajout des volumes identiques du tampon vers tous les exemples. Cela favorise similaires ex vivo la dilution des échantillons. Un tampon d’extraction de solution saline isotonique axée sur l’albumine est utilisée pour l’étape d’extraction ; Il permet l’extraction des médiateurs à base de protéines et stabilise les protéines afin de limiter la dénaturation pendant au gel des protéines éluées avant quantification. Pour éviter la dégradation des protéines pendant la phase d’extraction, un cocktail d’antiprotéases est ajouté dans le tampon d’extraction.
La mise en œuvre des techniques qui permettent la quantification des non perturbés, en vivo-générés médiateurs immunitaires muqueux sites est de la plus haute importance. Tout d’abord, le site muqueux constitue le plus grand organe immunitaire du corps. En second lieu, la localisation nasale est le principal site d’exposition et est étroitement reliée au compartiment immunologique respiratoire des poumons1. En troisième lieu, la possibilité de cet organe important avec une technique non invasive d’arpentage ouvre la possibilité de fournir une multitude d’informations sur l’axe de l’interaction de microbe-immunitaire importante en ce qui concerne la santé et la maladie des voies respiratoires. Quatrièmement, il existe de nombreuses autres applications possibles de cette technique, tels que les études locales altérations immunologiques dans les essais contrôlés randomisés des médicaments et des micronutriments.
Au départ, nous avons implémenté la technique dans les études prospectives de Copenhague sur l’asthme cohorte de2000 (COPSAC2000) de l’enfance, où nous avons déterminé le profil immunitaire du fluide muqueuse chez les enfants de 7 ans souffrant de rhinite allergique par rapport aux témoins sains,13. Par la suite, nous avons appliqué avec succès cette technique à la cohorte longitudinale de2010 COPSAC et profils immunitaire des voies aériennes mises en recouvrement à 1 mois, 2 ans et 6 ans et en cas de symptômes respiratoires aigus. Résultats des nouveau-nés âgés de 1 mois ont démontré des associations importantes entre la signature immunitaire et de la jeunesse exposition environnementale7,8,9,10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avec la technique présentée ici, nous avons pu déterminer le in vivo haute-voies respiratoires muqueux immunitaire profil chez les enfants dès 1 mois d’âge, qui n’a pas déjà été fait. Nous avons observé que la présence des bactéries des voies spécifiques et picornavirus7,11, ainsi qu’autres pré et périnatales expositions, ont été mis en miroir dans le profil immunitaire des voies aériennes des nouveaux-nés. En outre, nous avons u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous exprimons notre gratitude aux enfants et aux familles de l’étude de cohorte2010 COPSAC pour tout leur soutien et leur engagement. Nous reconnaissons et apprécions les efforts uniques de l’équipe de recherche COPSAC et l’aide technique de technicien Lisbeth Buus Rosholm, Université technique du Danemark, pour la mesure des cytokines et chimiokines.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
