Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus
Summary
Dit protocol beschrijft een noninvasive techniek voor de bemonstering van ongestoord mucosal voering vloeistof uit de bovenste luchtwegen. Het kan worden gebruikt voor het uitvoeren van de kwantificering van in vivo niveaus van proteïne bemiddelaars, zoals cytokines en chemokines, bij patiënten van alle leeftijden.
Abstract
Dit protocol beschrijft noninvasive bemonstering van ongestoord bovenste luchtwegen mucosal voering vloeistof. Het geeft ook de extractie procedure gebruikt voorafgaand aan de analyse van immuun bemiddelaars in vloeibare eluaten voor de studie van de actuele immuun handtekening airway, zonder de behoefte aan stimulatie-procedures (vaak gebruikt door andere technieken). De mucosal voering vloeistof wordt bemonsterd op een strook van filtreerpapier geplaatst op het voorste deel van het inferieur turbinate en links voor 2 min van absorptie. Analyten worden geëlueerd van de papieren filters, en de uitgepakte eiwit gebaseerde eluaten worden geanalyseerd door een electrochemiluminescence gebaseerde immunoassay, waardoor voor de kwantificering van de hoge gevoeligheid van laag – en hoog – niveau analyten in hetzelfde monster. Wij de niveaus in vivo 20 voorgeselecteerde immuun bemiddelaars aan specifieke immuun signalering trajecten in de mucosa van de bovenste luchtwegen gerelateerde gemeten, maar de techniek is niet beperkt tot die specifieke deelvenster of bemonstering site. De techniek werd voor het eerst geïmplementeerd in de 7-jarige kinderen van de prospectieve Studies van Kopenhagen op astma in jeugd2000 (COPSAC2000) cohort met allergische rhinitis. Daarna werd het gebruikt in de lengterichting COPSAC2010 geboortecohort, bemonsterd op 1 maand, 2 jaar en 6 jaar oud en in gevallen van acute respiratoire symptomen. Wij met succes verkregen en monsters van 620 (89%) van 700 kinderen van 1-maand-oude geanalyseerd; een paar monsters waren onder de detectiegrens van de assay (gerapporteerd als de mediaan (inter kwartiel bereik (IQR)). Het aantal monsters onder de detectiegrens (d.w.z. van 0 tot het punt van de reeks voor de ondergrens voor detectie) voor elke bemiddelaar was 29 (7.25-119,5). Deze techniek mogelijk maakt van de kwantificering van de in vivo airway mucosal immune profiel vanaf de geboorte, overlangs kan worden toegepast, en kan worden toegepast op studies over het effect van genetica en milieu posities van jeugd, pathofysiologie, endotyping, en monitoring van aandoeningen van de luchtwegen, en ontwikkeling en evaluatie van nieuwe therapieën.
Introduction
De vloeistof van de mucosal voering van de neus maakt het vloeibare deel van het systeem van de bovenste luchtwegen. Het bestaat uit een complexe matrix van bemiddelaars/mediators afgeleid van het samenspel tussen het epithelium en de immuuncellen die deel van de eerste lijn van verdediging uitmaken tegen invasie van micro-organismen. De nasale mucosa is gemakkelijk bereikbaar en er is een sterke functionele en immunologische relatie tussen de neus en de bronchiën1. Dit compartiment is van bijzonder belang met betrekking tot ziekten van de luchtwegen die in de kindertijd, zoals astma en allergische rhinitis, maar ook aan een aantal andere respiratoire aandoeningen vaker later in het leven gelden.
Hier beschrijven we de uitvoering van een methode om te monster ongestoord mucosal voering van de vloeistof uit de neusholte met behulp van een techniek filter papier gebaseerde, noninvasive, alsmede een daaropvolgende extractiemethode, gewend Elueer analyten uit het filtreerpapier voorafgaand aan hun kwantificering op basis van eiwitten. Deze techniek kan bijvoorbeeld worden gebruikt om te verkrijgen in vivo immuun handtekeningen van zowel gezonde personen en personen met verschillende aandoeningen van de luchtwegen. Bovendien is het mogelijk om posities van belang is voor een specifieke immuun handtekening onderzoeken en te beoordelen of het is een voorspeller of bemiddelaar van latere ontwikkeling van de ziekte.
Mucosal voering vloeistof is eerder verkregen door nasale lavage2, die wordt vaak voorafgegaan door een test op neus uitdaging, waar een allergeen is geïntroduceerd in hoge mate ter stimulering van een ontstekingsreactie3,4. Echter, de techniek van de nasale lavage is niet haalbaar bij jonge kinderen en introduceert een onbekende verdunningsfactor, die de resultaten, als de verdunde bemiddelaar niveaus onder de detectiegrens van de bepaling5 vallen kunnenkunstdiscours. Bovendien, als gevolg van de onbekende verdunningsfactor, de gemeten analyt reacties van de nasale uitdaging-tests zijn niet vergelijkbaar tussen individuen, waardoor het beperken van het nut van de techniek van de nasale lavage in een cohort instellen. Tenslotte allergeen uitdaging is alleen van toepassing bij gesensibiliseerde personen, en andere uitdagingen, zoals de histamine-uitdaging, zijn niet fysiologisch relevant, mogelijk veroorzaakt een plafond effect op vrijlating van de bemiddelaar. Deze problemen worden omzeild in de gepresenteerde filtreerpapier gebaseerde techniek voor mucosal voering vloeistof collectie, waar de individuele secretie van vloeistoffen en niveaus van het analyt zijn de enige factoren die van invloed zijn Inter-individuele variatie.
Tijdens de extractie procedure, worden analyten geëlueerd uit het filtreerpapier na toevoeging van identieke volumes van buffer aan alle samples. Dit gunsten soortgelijke ex vivo verdunning van alle monsters. De buffer van een extractie van albumine gebaseerde isotone zoutoplossing wordt gebruikt voor de extractie stap; het maakt de winning van bemiddelaars op basis van eiwitten en eiwitten om te beperken denaturatie tijdens de daaropvolgende bevriezing van geëlueerd eiwitten vóór kwantificering stabiliseert. Om te voorkomen dat de aantasting van het eiwit tijdens de winning fase, wordt een cocktail van proteaseinhibitors toegevoegd aan de extractie-buffer.
De toepassing van technieken die het mogelijk voor de kwantificering van ongestoord, in vivo maken-gegenereerde immuun bemiddelaars op mucosal sites is van het allergrootste belang. Ten eerste, de mucosal site maakt het grootste immunologisch orgaan in het lichaam. Ten tweede, de nasale locatie is van de primaire site van airborne blootstelling en is nauw verbonden met de respiratoire immunologische compartiment van de longen1. Ten derde, de mogelijkheid van de landmeetkunde dit belangrijke orgaan met een noninvasive techniek opent de mogelijkheid om een overvloed aan informatie op de as van de belangrijke microbe-immuun interactie met betrekking tot gezondheid en ziekte in de luchtwegen. Ten vierde, er zijn vele andere mogelijke toepassingen van deze techniek, zoals het bestuderen van lokale immunologische veranderingen in gerandomiseerde, gecontroleerde proeven van drugs en micronutriënten.
Aanvankelijk wij de techniek in de prospectieve Studies van Kopenhagen op astma in jeugd2000 (COPSAC2000) cohort, waar wij het immuun Profiel van de mucosal voering vloeistof in de 7-jarige kinderen met allergische rhinitis versus gezonde controles13 vastbesloten. Vervolgens, we met succes toegepast deze techniek op de longitudinale COPSAC2010 cohort en beoordeelde airway immuun profielen op 1 maand, 2 jaar en 6 jaar oud en in gevallen van acute respiratoire symptomen. Resultaten van het 1-maand-oude pasgeborenen hebben aangetoond dat belangrijke associaties tussen de immuun handtekening en de milieublootstelling jeugd7,8,9,10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met de techniek die hier gepresenteerd, konden we om te bepalen van het in vivo Opper-airway mucosal immune profiel bij kinderen vanaf zo spoedig 1 maand oud, die niet eerder is gebeurd. We hebben vastgesteld dat aanwezigheid van specifieke airway bacteriën en picornaviruses7,11, evenals andere pre en perinatale posities, werden weerspiegeld in de luchtweg immuun Profiel van de pasgeborenen. Bovendien, we deze airway immuun profielgegevens gebruikt bij …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We onze dankbaarheid uiten aan de kinderen en de gezinnen van de COPSAC2010 cohortstudie voor al hun steun en inzet. We erkennen en waarderen van de unieke inspanningen van het onderzoeksteam van COPSAC en de technische hulp van technicus Lisbeth Buus Rosholm, Technische Universiteit van Denemarken, voor het meten van cytokines en chemokines.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
References
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
