黏膜衬里流体为体内上呼吸道免疫介质水平量化的无创性取样
Summary
此协议说明采样的原状黏膜衬里流体从上呼吸道非侵入性方法。它可以用于执行量化的体内水平的蛋白质介质，如细胞因子和趋化因子，在各个年龄段的主题。
Abstract
此协议说明原状的上呼吸道黏膜衬里流体的取样。它还详细介绍了之前在流体溶提免疫调解分析用于研究气道局部免疫签名，而不需要刺激程序 （经常使用的其他技术） 的提取工艺。黏膜衬里流体采样滤纸条上放置在前部的下鼻甲及左 2 分钟的吸收。分析物从滤纸，洗脱和提取基于蛋白质的洗脱液基于电致化学发光免疫分析法，允许高级别中的分析物同一样品的高灵敏度量化分析。我们测量 20 预选免疫调解有关的信号转导通路在上呼吸道粘膜的特异性免疫的体内含量，但技术并不局限于该特定的面板或采样点。第一次在 7 岁儿童从哥本哈根前瞻性研究哮喘在变应性鼻炎的童年2000年(COPSAC2000年) 队列中实现了技术。此后，它被用在纵向 COPSAC2010的出生世代，采样在 1 个月、 2 年和 6 年的年龄和急性呼吸道症状的实例。我们成功地获得和分析样品从 620 （89%) 的 700 名 1 个月岁儿童; 几个样品均低于检测检出限 （据中位数 (四分位数范围 (IQR))。低于检测限 （即从 0 到设定点下限为） 为每个调解员样本数目是检测的 29 (7.25-119.5)。这种技术使体内气道粘膜免疫配置文件从出生的量化，可以纵向，应用和可应用于研究遗传学和早期生活环境暴露、 病理生理学、 endotyping，和监测呼吸系统疾病，以及发展和评价的新型疗法的疗效。
Introduction
鼻黏膜衬里流体弥补了上呼吸道系统的液体部分。它是由复杂的矩阵的调解员来自上皮和弥补防御入侵的微生物的第一行的免疫细胞之间的相互作用。鼻黏膜是方便，还有鼻子和支气管1强大功能和免疫学关系。这种间隔是特别感兴趣就是在童年，如哮喘和变应性鼻炎，但也对一系列的以后的生活中更为普遍其他呼吸道疾病中常见的呼吸道疾病。
在这里，我们描述与样品不受干扰的黏膜衬里流体从鼻腔用基于过滤纸、 无创的技术，以及以后的提取过程，用来洗脱基于蛋白质的分析物从过滤纸之前，其量化方法的实现。这种技术为例，可以用于获取体内免疫签名的健康个体和个人的多种呼吸道疾病。此外，有可能审查暴露为一个特定的免疫签名的重要性，并评价如果它是一个预测或以后的疾病发展的调停者。
黏膜衬里液得到以前了鼻腔灌洗2，这之前通常会出现鼻内激发试验，在高水平，以刺激炎症反应3，4，过敏原介绍了。。然而，鼻腔灌洗技术在年幼的孩子是不可行和介绍了未知的稀释因子，迷惑的成果，作为水平可以低于检测限的测定5稀释调解员。此外，由于未知的稀释因子，从鼻内激发试验的实测分析物反应不可同日而语之间个人，从而限制了鼻腔灌洗技术在设置队列的有用性。最后，过敏原挑战只是适用在敏化的主题，和其他挑战，如组胺的挑战，不是生理上有关，有可能导致对介质释放的天花板效应。在提出的基于过滤纸的技术为黏膜衬里流体集合，在那里个别分泌液和分析物水平是影响个体间方差的唯一因素规避了这些问题。
在提取过程中，分析物是从洗脱过滤纸相同的卷的缓冲区在加入后的所有样品。这有利于类似体外稀释的所有样品。基于白蛋白的等渗盐溶液提取缓冲区用于提取步骤;它支持基于蛋白质的调解员的提取和稳定限制之前，量化洗脱蛋白质在随后冻结变性的蛋白质。为了避免在提取阶段的蛋白质降解，蛋白酶抑制剂的鸡尾酒被加入提取缓冲液。
允许不受干扰，体内的量化的技术执行-粘膜部位生成免疫调解员是至关重要。首先，粘膜网站构成了最大的免疫器官，在正文中。第二，鼻位置是机载暴露在主站点和紧密连接到肺1呼吸系统免疫室。第三，测量与无创技术这重要器官的可能性打开的可能性与健康和疾病的气道重要微生物免疫相互作用轴上提供大量的信息。第四，有很多其他可能的应用，这种技术，例如研究当地的免疫学改变的随机对照试验的药物和微量营养素。
我们最初在童年2000年(COPSAC2000年) 队列，在那里我们确定免疫流体分布的黏膜衬里在变应性鼻炎与健康对照组137 岁患儿在哥本哈根前瞻性研究哮喘实施技术。随后，我们成功地将此技术应用到 COPSAC2010的纵向队列和分摊气道免疫配置文件在 1 个月、 2 年和 6 年的年龄和急性呼吸道症状的实例。从 1 个月岁新生儿表明免疫签名和早期生活环境暴露7，8，9，10，，1112之间的重要关联。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的技术，我们得以确定体内上呼吸道黏膜免疫中的配置文件从早在 1 个月的年龄，以前也没有过以前的儿童。我们观察到这种存在的特定气道细菌和核糖核酸7，11，以及其他前和围产期风险敞口，映出的气道新生儿免疫配置文件中。此外，我们用这些气道免疫配置文件数据来研究高剂量维生素 D.随机微量营养素审判的作用机制这些结果?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢我们向儿童和家庭的 COPSAC2010队列研究他们的支持和承诺。我们承认并感谢 COPSAC 的研究团队和技术帮助从技术员利斯贝思 Buus 罗斯霍尔姆，丹麦技术大学的细胞因子和趋化因子测量的独特努力。
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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