Vivo में ऊपरी Airway प्रतिरक्षा-मध्यस्थ स्तर की मात्रा का ठहराव के लिए Mucosal अस्तर द्रव का noninvasive नमूना
Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए ऊपरी वायुमार्ग से अबाधित mucosal अस्तर तरल पदार्थ का नमूना एक noninvasive तकनीक का वर्णन करता है। यह सभी उम्र के विषयों में vivo में साइटोकिन्स और chemokines, जैसे, प्रोटीन मध्यस्थों के स्तर की मात्रा का ठहराव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
Abstract
इस प्रोटोकॉल noninvasive नमूना अबाधित ऊपरी airway mucosal अस्तर तरल पदार्थ का वर्णन करता है। यह भी निष्कर्षण प्रक्रिया का अध्ययन airway सामयिक प्रतिरक्षा हस्ताक्षर, उत्तेजना प्रक्रियाओं (अक्सर अन्य तकनीकों के द्वारा प्रयोग किया जाता) के लिए की आवश्यकता के बिना के लिए तरल पदार्थ eluates में प्रतिरक्षा मध्यस्थों के विश्लेषण से पहले इस्तेमाल किया जानकारी। के mucosal परत तरल पदार्थ फिल्टर पेपर की एक पट्टी पर जांचा जाता अवर अवशोषण के 2 मिनट के लिए छोड़ दिया और turbinate के पूर्वकाल भाग में रखा। Analytes फिल्टर पेपर से eluted कर रहे हैं, और उच्च संवेदनशीलता कम और उच्च स्तरीय analytes एक ही नमूने की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता किसी electrochemiluminescence-आधारित immunoassay, द्वारा निकाली गई प्रोटीन-आधारित eluates विश्लेषण कर रहे हैं। हम विशिष्ट रास्ते ऊपरी airway mucosa में संकेतन प्रतिरक्षा से संबंधित 20 preselected प्रतिरक्षा मध्यस्थों के vivo में स्तर मापा जाता है, लेकिन तकनीक उस विशिष्ट कक्ष या नमूना साइट करने के लिए सीमित नहीं है। तकनीक पहले एलर्जी rhinitis के साथ बचपन2000 (COPSAC2000) पलटन में अस्थमा पर कोपेनहेगन भावी अध्ययन से 7 साल के बच्चों में लागू किया गया था। यह बाद अनुदैर्ध्य COPSAC2010 जन्म काउहोट, 1 माह, 2 साल और 6 साल की उम्र में और तीव्र श्वसन लक्षण की आवृत्तियों पर नमूना में इस्तेमाल किया गया था। हम सफलतापूर्वक प्राप्त की और 700 1 महीने की उम्र बच्चों के 620 (89%) से नमूनों का विश्लेषण किया, (माध्य (इंटर-चतुर्थक रेंज (IQR)) के रूप में की सूचना दी. परख का पता लगाने सीमा के नीचे कुछ नमूने थे प्रत्येक मध्यस्थ के लिए (अर्थात 0 से निचली सीमा का पता लगाने के लिए सेट बिंदु करने के लिए) का पता लगाने सीमा के नीचे नमूनों की संख्या 29 (7.25-119.5) था। इस तकनीक में vivo airway श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल जन्म से मात्रा का ठहराव सक्षम बनाता है, longitudinally लागू किया जा सकता, और आनुवंशिकी और प्रारंभिक जीवन पर्यावरण जोखिम, pathophysiology, endotyping, और सांस की बीमारियों, और विकास और उपन्यास चिकित्सा विज्ञान का मूल्यांकन की निगरानी के प्रभाव पर अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता।
Introduction
नाक के mucosal परत द्रव तरल प्रणाली के भाग ऊपरी-airway अप बनाता है। यह एक जटिल मैट्रिक्स उपकला और प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि सूक्ष्मजीवों पर हमले के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति को बनाने के बीच परस्पर क्रिया से व्युत्पन्न मध्यस्थों के होते हैं। नाक mucosa आसानी से पहुँचा जा सकता है, और नाक और ब्रांकाई के साथ1के बीच एक मजबूत कार्यात्मक और प्रतिरक्षाविज्ञानी संबंध है। इस डिब्बे airway रोग है कि बचपन, जैसे कि अस्थमा और एलर्जी rhinitis, लेकिन यह भी अन्य सांस की बीमारियों के बाद के जीवन में अधिक प्रचलित श्रेणी में आम है के संबंध में विशेष रुचि का है।
यहाँ, हम नमूना अबाधित mucosal अस्तर नाक गुहा से तरल पदार्थ एक फिल्टर पेपर-आधारित noninvasive, तकनीक, के रूप में अच्छी तरह से एक बाद निष्कर्षण प्रक्रिया का उपयोग कर, उनकी मात्रा का ठहराव से पहले फ़िल्टर कागजात से प्रोटीन-आधारित analytes elute करने के लिए उपयोग करने के लिए एक विधि के कार्यान्वयन का वर्णन। इस तकनीक में vivo दोनों स्वस्थ व्यक्तियों और विभिन्न सांस की बीमारियों के साथ व्यक्तियों के प्रतिरक्षा हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए उदाहरण के लिए, इस्तेमाल किया जा सकता। इसके अलावा, यह एक विशिष्ट प्रतिरक्षा हस्ताक्षर के लिए महत्व के जोखिम की जांच करने के लिए और यह एक कारक या बीमारी के बाद विकास के मध्यस्थ है मूल्यांकन करने के लिए संभव है।
Mucosal अस्तर द्रव पहले जो अक्सर एक नाक चुनौती परीक्षण द्वारा, जहां एक allergen एक भड़काऊ प्रतिक्रिया3,4को प्रोत्साहित करने के लिए उच्च स्तर में शुरू की गई है पहले है नाक lavage2, द्वारा प्राप्त किया गया है। हालांकि, नाक lavage तकनीक युवा बच्चों में संभव नहीं है और एक अज्ञात कमजोर पड़ने कारक है जो पतला मध्यस्थ स्तर परख5के पता लगाने सीमा के नीचे गिर कर सकते हैं के रूप में यह परिणाम, घालमेल कर दिया है, का परिचय देता है। इसके अलावा, अज्ञात कमजोर पड़ने कारक के कारण, नाक चुनौती परीक्षणों से मापा analyte प्रतिक्रिया जिससे एक काउहोट सेटिंग में नाक lavage तकनीक की उपयोगिता सीमित व्यक्तियों, के बीच तुलना नहीं कर रहे हैं। अंत में, allergen चुनौती केवल ही विषयों में लागू है, और अन्य चुनौतियों, histamine चुनौती है, जैसे physiologically प्रासंगिक, संभावित रूप से मध्यस्थ रिलीज पर एक छत प्रभाव पैदा नहीं कर रहे हैं। इन समस्याओं के mucosal परत तरल पदार्थ संग्रह, जहां तरल पदार्थ और analyte स्तरों का अलग-अलग स्राव केवल कारक है कि अंतर-व्यक्तिगत विचरण को प्रभावित कर रहे हैं के लिए प्रस्तुत फिल्टर पेपर-आधारित तकनीक में circumvented है कर रहे हैं।
निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान, analytes से फ़िल्टर कागज के अलावा बफर की समान मात्रा के बाद सभी नमूनों को eluted कर रहे हैं। यह इसी तरह पूर्व vivo कमजोर पड़ने सभी नमूनों के पक्ष में है। एक निष्कर्षण बफर isotonic नमक एल्ब्युमिन-आधारित समाधान के निष्कर्षण चरण के लिए उपयोग किया जाता है; यह प्रोटीन आधारित मध्यस्थों के निष्कर्षण में सक्षम बनाता है और प्रोटीन eluted प्रोटीन मात्रा का ठहराव से पहले के बाद ठंड के दौरान denaturation सीमित करने के लिए स्थिर। निष्कर्षण चरण के दौरान प्रोटीन क्षमता अवक्रमण से बचने के लिए, एक कॉकटेल protease inhibitors के निष्कर्षण बफ़र के लिए जोड़ा गया है।
तकनीक है कि अबाधित, vivo मेंकी मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देने के कार्यान्वयन-श्लैष्मिक स्थलों पर उत्पन्न प्रतिरक्षा मध्यस्थों का अत्यंत महत्व है। सबसे पहले, सबसे बड़ा प्रतिरक्षाविज्ञानी अंग शरीर में श्लैष्मिक साइट बनाता है। दूसरा, नाक स्थान हवाई संपर्क की प्राथमिक साइट है और कस1फेफड़ों का सांस प्रतिरक्षाविज्ञानी डिब्बे करने के लिए कनेक्ट किया गया है। तीसरा, एक noninvasive तकनीक के साथ इस महत्वपूर्ण अंग का सर्वेक्षण करने की संभावना संभावना है स्वास्थ्य और वायुमार्ग में रोग के संबंध में महत्वपूर्ण सूक्ष्म जीव-प्रतिरक्षा बातचीत अक्ष पर जानकारी का एक बहुतायत प्रदान करने के लिए खोलता है। चौथा, वहाँ कई अन्य संभावित अनुप्रयोगों जैसे कि ड्रग्स और माइक्रोन्यूट्रेंट्स के यादृच्छिक, नियंत्रित परीक्षण में स्थानीय प्रतिरक्षाविज्ञानी परिवर्तन का अध्ययन कर इस तकनीक का कर रहे हैं।
हम शुरू में तकनीक में अस्थमा पर कोपेनहेगन भावी अध्ययन बचपन2000 (COPSAC2000) पलटन, कहाँ हम mucosal अस्तर द्रव स्वस्थ नियंत्रण13बनाम एलर्जी rhinitis के साथ 7 साल के बच्चों में प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल निर्धारित में लागू किया गया। बाद में, हम सफलतापूर्वक इस तकनीक अनुदैर्ध्य COPSAC2010 पलटन और मूल्यांकन airway प्रतिरक्षा प्रोफाइल के लिए 1 महीना, 2 साल और 6 साल की उम्र में और तीव्र श्वसन लक्षण की आवृत्तियों पर लागू। परिणाम 1-महीने पुराने नवजात से प्रतिरक्षा हस्ताक्षर और प्रारंभिक जीवन पर्यावरण जोखिम7,8,9,10,11,12के बीच महत्वपूर्ण संघों का प्रदर्शन किया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत की गई तकनीक के साथ, हम vivo में ऊपरी-airway श्लैष्मिक प्रतिरक्षा प्रोफ़ाइल 1 महीने की उम्र, जो पहले नहीं किया गया है के रूप में के रूप में जल्दी से बच्चों में यह निर्धारित करने में सक्षम थे। हम न…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सभी अपने समर्थन और प्रतिबद्धता के लिए बच्चों और COPSAC2010 काउहोट अध्ययन के परिवारों के लिए हमारे आभार व्यक्त करते हैं। हम स्वीकार करते हैं और COPSAC अनुसंधान टीम और तकनीशियन Lisbeth Buus Rosholm, डेनमार्क के तकनीकी विश्वविद्यालय, से तकनीकी सहायता और माप के लिए साइटोकिन्स chemokines के अद्वितीय प्रयासों की सराहना करते हैं।
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
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