Summary
פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.
Abstract
במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מקוצרת fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. ? הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) solubilizes ביעילות באופן מקורי מקופל חלבונים ברקמת המוח המאפשר את העשרת של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מתוך מגוון רחב של proteinopathies ניווניות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון, נוירודגנרטיביות ומחלות פריון. לשליטת האדם ורקמות המוח לאחר המוות לספירה היו הומוגני, sedimented על ידי ultracentrifugation בנוכחות sarkosyl להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס כולל פיפטות phosphorylated טאו, מרכיב מרכזי neurofibrillary קשרים לספירה. סופג המערב הפגינו המסיסות דיפרנציאלית של טאו phosphorylated צבור, החלבון דטרגנט מסיסים, מוקדם 1 אנטיגן אנדוזום (EEA1) ב AD המוח ובקרה. ניתוח פרוטיאומיה מבנית גם גילה העשרה של β-עמילואיד (Aβ), טאו, snRNP70 (U1 - 70 K), ו אפוליפופרוטאין E (ספקיות) ב sarkosyl-לא מסיס שברים של המוח לספירה בהשוואה לאלו של שליטה, בקנה אחד עם אסטרטגיות fractionation רקמות הקודם . לפיכך, פרוטוקול העשרה פשוטה זה הינו אידיאלי עבור מגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי חלבון פונקציונלי צבירת שיתוף מבחני פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה.
Introduction
מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS) ומחלות של פריון הקשורים קשר הדוק הן proteinopathies מאופיין על ידי הצטברות הדרגתית של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס במוח. עם ליווי קוגניטיבית לסרב. 1 , 2 תכונה פתולוגית משותפת זו הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי אטיולוגיה, פתופיזיולוגיה של אלה מחלות ניווניות. 2 אגרגטים אלה בדרך כלל מורכבים של סיבי עמילואיד פולימריים, אשר מורכבים של חוזרות יחידות של חלבונים misfolded מפגין צלב β-מבנה. 1 , 2 , 3 , 4 . מבחינה ביוכימית, אגרגטים עמילואיד הם עמידים מאוד בפני דנטורציה כימי או תרמי ו- solubilization,3 אשר מציג אתגרים ייחודיים על טיהור שלהם, ניתוח וללמוד באמצעות טכניקות מסורתיות הביוכימי. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 באופן לא מפתיע, השבר לא מסיס-אבקת חלבון הייתה המוקד של מחקרים רבים לתוך הפתופיזיולוגיה של מחלות ניווניות הקשורות ההצטברות של חלבונים misfolded. 6 , 12 , 13 , 14
טכניקות fractionation הביוכימי כבר נעזרו לעיתים קרובות כדי להעשיר את השבר דטרגנט-לא מסיס מן המוח לאחר המוות homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 באחת השיטות הנפוצות ביותר כרוך החילוץ רציפים של רקמת homogenates עם מאגרי וחומרי ניקוי של הגדלת לכתחילה, ואחריו ultracentrifugation מחיצות שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. נפוץ fractionation רציפים פרוטוקול6,14 מערבת את המגון דגימות רקמה קפוא במאגר מלח נמוכה ללא דטרגנט (האם), כדורי לא מסיסים תוצאות ואז מופקים באופן רציף עם מאגרי המכילה מלח גבוהה, חומרי ניקוי ללא יונית, סוכרוז גבוהה, דטרגנטים יוניים, ולבסוף chaotropes כמו שתנן. 6 , 14 חסרון ברור מהפרוטוקולים fractionation רציפים הוא זמן ניכר ומחויבות לעבודה הדרושה כדי להשלים אותם. כולל המגון ultracentrifugation, פרוטוקול טיפוסי fractionation חמישה צעדים יכולה לקחת כמה שעות או אפילו ימים כדי להשלים. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 . בנוסף, אגרגטים חלבון פיפטות רבים נותרים מסיסים בסך הכל, אבל ה19,החריפה תנאים20 רוב השברים שנוצר הם בעלי ערך מוגבל. כך, המדרגות fractionation פחות מחמירים ניצול ריכוז המלח גבוה ודטרגנטים ללא יונית הם במידה רבה מיותר.
מחקרים קודמים הראו כי הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) הוא מועמד מצוין עבור פרוטוקול fractionation דטרגנט מפושטת של צעד אחר צעד. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 כמו חומר ניקוי denaturing, sarkosyl היא מחמירה מספיק כדי solubilize הרוב המכריע של חלבונים מקופלים מקורי במוח ללא solubilizing אגרגטים חלבון misfolded המורכב בטא עמילואיד (Aβ),6,11 טאו phosphorylated (pTau),6 זפת DNA מחייב חלבון 43 (TDP-43),14 אלפא-synuclein,12,13 scrapie,23 או U1 קטן הגרעין ribonucleoproteins (U1 snRNPs) כגון U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 כמו sarkosyl הוא פחות מחמירים יותר סולפט dodecyl בכל מקום anionic נתרן דטרגנט (מרחביות), שומרת על צורות oligomeric פחות חזקים של אגרגטים חלבון misfolded שלא יכול לעמוד טיפול מרחביות. 9
בעבר, תיאר לנו פרוטוקול דטרגנט-fractionation מקוצר להשיג תוצאות להשוות מתודולוגיות fractionation רציפים יותר מפרך. 5 על-ידי השמטת את השלבים fractionation מחמירים פחות, הצלחנו לפתח פרוטוקול נתיישב fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. 5 פרוטוקול מפורט זה המתוארים בזאת הוא גם מתאים למגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי, מבחני מבוססי ספקטרומטר מסה פרוטאומיקס חלבון פונקציונלי misfolding, צבירת זריעה. 5 , 6 , 21
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אתיקה במשפט: לכל רקמות מוח, התקבלו האלצהיימר אמורי ' s מחלות מחקר במרכז (ADRC) המוח הבנק. רקמות לאחר המוות נרכשו תחת פרוטוקולים לוח סקירה מוסדיים (IRB) תקין.
1. המגון ו Fractionation
- רקמות הבחירה
הערה: קפוא רקמות לאחר המוות החזיתית מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי מקרים מאושרים של המודעה נבחרו מתוך אמורי ADRC המוח הבנק (n = 2). הערכה neuropathological פוסט-מורטם של הפצה פלאק עמילואיד בוצעה על פי האיחוד להקים רישום עבור אלצהיימר ' s המחלה למחצה כמותיים ניקוד קריטריונים 24, למרות סבך neurofibrillary פתולוגיה הוערך לפי מערכת הזמני braak. 16- קבל קפוא רקמת המוח לאחר המוות מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי לספירה מקרים מאומתים. ניצול מיכלים של קרח יבש, מלקחיים, סכין גילוח, בלו ~ 250 מ"ג חלקים של החומר האפור של כל דגימה רקמה על הפנויה tared שוקל סירות, לטפל כדי למנוע את הרקמה מפשיר. להקליט את המשקל של כל פיסת להיות הומוגני.
- בלו ~ 250 מ"ג של החומר האפור באמצעות מלקחיים, גילוח על-ידי בדיקה חזותית כדי לאתר את הממשק בין החומר האפור החיצוני לבין חומר לבן פנימי. להימנע חומר לבן וחשוב יותר, כל כלי דם גדולים או אזורים מדם, קרומי המוח או מאטר מעידה. לשמור את הרקמה קפוא במהלך תהליך חיתוך על ידי עובדים במהירות והצבת לעתים קרובות הסירה במשקל עם רקמת המוח לתוך מיכלים פוליסטירן עם קרח יבש
- רושמות את משקל מדויק של החומר האפור טוחנות מ כל חתיכה קפוא באמצעות איזון האנליטי. חישוב הנפח של מאגר מלח נמוכה (LS) (ראה טבלה 1) לצורך המגון דאונס (5 מ ל/g או 20% w/v).
- 10 להכין מאגר מ ל LS עם 1 x מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל ולא צונן על קרח
- להסיר רקמות שנשקל והסירה במשקל קרח יבש והן הקוביות לחתיכות מ מ 2 x 2 בערך כמו זה מפשירה. העברת צינור מהמגן 2 מ"ל דאונס טרום מקורר על קרח
- הוסף 5 מ ל/g (20% w/v) מאגר מלח נמוכה כקרח (LS) עם 1 X מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל.
- Homogenize רקמת המוח על קרח באמצעות כ 10 קווים של סיווג גבוהות שהעקב A ו- 15 משיכות של סיווג נמוך שהעקב B.
- העברת homogenate כל צינור פוליפרופילן 2 mL באמצעות כוס פסטר פיפטה. תווית ברכבת התחתית עם “ תאנון ” (כולל Homogenate), הרקמה קייס המספר, homogenate נפח. Aliquot 0.8 מ לתוך צינור שכותרתו mL 1.5. כל homogenate עודף יכול להיות דומה aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס
- כל 0.8 מ ל aliquot, להוסיף 100 µL כל של 5 M NaCl ו- 10% (w/v) sarkosyl ריכוזים של 0.5 M ו- 1% w/v, בהתאמה. לערבב צינורות היטב על ידי היפוך, דגירה על קרח במשך 15 דקות צינורות בתווית עם " ה-S " (סה כ Homogenate-Sarkosyl) כדי לציין homogenates פועלות sarkosyl-מאגר (טבלה 1).
- Sonicate כל שפופרת עבור s 5 3 פולסים במהירות של 30% משרעת על קרח (העוצמה המקסימלית = 40%) באמצעות בדיקה microtip.
- לקבוע ריכוז חלבון homogenates באמצעות החומצה bicinchoninic (BCA) assay 25 שיטת.
הערה: ריכוז חלבון הממוצע של ה-S homogenates מוכן ב 5 מ ל LS לגרם של רקמות היא 15-20 מ"ג/מ"ל. Homogenates ניתן fractionated מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C עד השימוש. - Homogenates ה-S לדלל כדי 10 מ"ג/מ"ל באמצעות מאגר סארק כקרח (טבלה 1) עם 1 x מעכבי פרוטאז, פוספטאז.
- להעביר 5 מ ג חלבון (0.5 מ ל) של כל אחד homogenate ה-S לתוך 500 µL פוליקרבונט ultracentrifuge צינורות, זוג-איזון עם סארק-buffer. לטעון צינורות לתוך טרום מקורר רוטור ultracentrifuge ב 180,000 x g למשך 30 דקות ב- 4 supernatants העברה sarkosyl מסיסים מעלות צלזיוס (S1) כדי 1.5 mL צינורות ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס
הערה: (שטיפת אופציונלי) µL להוסיף 200 סארק-המאגר כדי ultracentrifuge צינורות המכילים שברים דטרגנט-לא מסיס (P1) ועוקרות כדורי (P1) מהחלק התחתון של הצינורות ultracentrifuge באמצעות טיפ פיפטה 200 µL. - בקצרה את הדופק-ספין הפוך צינורות עבור s 2-3 (≤ 2,500 x g) ב- microcentrifuge כדי להעביר את החבילות (P1) ואת מאגר הצינורות 1.5 mL להלן. Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) במאגר-סרק על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח בגדר מופרת.
- זוג-איזון, צנטריפוגה ב 180,000 x g למשך 30 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס
- למחוק את תגובת שיקוע שטיפת אופציונלי (S2), דגירה כדורי sarkosyl-לא מסיס (P2) ב- 50-75 µL מאגר אוריאה (טבלה 1) עם 1 x תמונה (פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי solubilize צניפה-
הערה: מאגר אוריאה חמים לטמפרטורת החדר לפני השימוש כדי למנוע מרחביות משקעים. ליישומים הרגישים דטרגנט, להשמיט זמנים תוססים מהמאגר אוריאה ולשקול שטיפה בגדר לא מסיסים (P2) במאגר מלח נמוכה לפני resuspending במאגר שתנן. - להעביר את כדורי resuspended (P2) צינורות 0.5 mL ולהשתמש קצר (1 s) microtip sonication-משרעת 20% (העוצמה המקסימלית = 40%) כדי באופן מלא solubilize כדורי.
- לקבוע את ריכוזי חלבונים מסיסים sarkosyl (S1) ו- assay לא מסיסים שברים (P2) באמצעות BCA את השיטה. להשתמש שברים אלה באופן מיידי או לאחסן ב- 80 ° C עד שימוש.
2. Immunoblotting
- המערבי סופג
הערה: סופג המערבית בוצעה על פי הנהלים שדווחה בעבר עם שינויים קלים. 5 , 10- 40 להכין דגימות µg סה כ homogenates (ה-S), סארק מסיסים (S1), סארק-לא מסיס שברים (P2) במאגר מדגם X Laemmli מרחביות-דף 1 עם 5 מ מ TCEP pH 7. דגירה בדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק דוגמאות
- טען ב- Bis-טריס precast 10-ובכן 4-12% מרחביות-דף ג'ל. Electrophorese-80 V על הסנטימטר הראשונה (10 דקות) ו 120 V עד לתום (60 דקות) או עד לצבוע מעקב מגיע לתחתית של הג'ל.
- להשתמש טריים גילוח וסכין ג'ל על פיצול-פתיחה בקלטת ג'ל טרומי. בעדינות לחתוך משם את קומבס ואת התחתון של הג'ל עם סכין גילוח טריים.
- Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) 200 µl סארק-מאגר עם x 1 PIC על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
- העברת קרום ניטרוצלולוזה 0.2 µm באמצעות שיטת העברה יבש על מכונת blotting (ראה טבלת חומרים).
- לחסום את הקרום במאגר חסימה (BB) ללא Tween 20 למשך 30 דקות, ואחריו עם BB עם 0.05% 20 Tween (BB/T) למשך 30 דקות. לאחר חסימת, לשטוף את הקרום ב- TBS/T (0.1% Tween 20) עבור 5 דקות כדי להסיר עודפי מאגר חסימה.
- הכן דילולים 1:1,000 של נוגדנים ראשי pT231, טאו-2 (פאן טאו), AT8 ו EEA1 ב BB/T (0.05% Tween 20).
- תדגור על הממברנות בפתרון נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C עם עצבנות מעגלית לשטוף את הקרום ב- TBS/T עבור 3 x 15 דק
- בדיקה הקרום לדילול 1:20,000 שכותרתו fluorescently ליד-IR משני הנוגדן ב- BB/T עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך בשייקר. לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות ב- TBS/T ו- 2 x 5 min ב- TBS.
- לסרוק את הקרום באמצעות אינפרא מערכת-הגל המתאימים עירור (לדוגמא 700 nm (ערוץ אדום) עבור צבע אינפרא-אדום 680 עז העכבר אנטי איג (H + L) המשנית, 800 nm (ערוץ ירוק) עבור צבע אינפרא-אדום 790 החמור נגד אינץ ארנב IgG (H + L הדמיה ) משני).
- משתמש בתוכנת הדמיה לכמת עוצמות האות ולבצע מדידות densitometry לפי היצרן ' s הוראות, הבטחת אוטומטי-רקע הגדרת מוגדר ממוצע את הרקע כולו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול sarkosyl צעד אחר צעד מקוצרת-fractionation שימש להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס של שליטה והמוח לספירה לאחר המוות (איור 1). חלבונים מן ה-S, S1, S2 ו- P2 שברים שנפתרו על ידי עמודים מרחביות, קבוע למשך 15 דקות Coomassie מאגר מקבע כחול ולאחריו מכתים עדין עם מאגר מוכתמים G-250 Coomassie כחול מבריק. הצעד resuspension הוא אופציונלי, מכיוון שהיו רמות לא לגילוי של חלבון השבר S2 (ראה 1.1.14). תספיג ניתוח (איור 2 א ו- B) מדגים בבירור כי במוח לספירה, מצרפי משקל מולקולרי גבוה פיפטות phosphorylated טאו היו sarkosyl-לא מסיס, נשאר מעט מאוד pTau שברים sarkosyl מסיסים. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 . לעומת זאת, הרוב המכריע של pTau במוח שליטה לחלקו ל השבר sarkosyl מסיסים. 5 , 6 , 10 , לעומת זאת, EEA1 בעיקר מחיצות לתוך השבר S1 שליטה והן המוח לספירה (איור 2C). כאן, EEA1 משמש סמן כללי חלבונים טבעית ביותר, הלא-פיפטות שאינם מסיסים מטבעו sarkosyl5. ראוי לציין, יש מעט פחות סיגנל EEA1 ב השבר מסיסים (S1) לעומת השבר ה-S, המציינת כי סביר sarkosyl-לא מסיס, עדיין מתחת לגבול של זיהוי על ידי תספיג עם נוגדנים מסוימים זה מאגר קטן של EEA1. זה באותה מידה ייתכן לירידה קלה תירלולסה תשרה לש EEA1 ב השבר מסיסים (S1) נובע מחייב שאינם ספציפיים של EEA1 הצינורות ultracentrifuge יכול גם להסביר סטייה קלה התוצאות הצפויות.
כדי benchmark את היעילות של פרוטוקול מקוצרת fractionation צעד אחר צעד (איור 3 א) כנגד המתודולוגיה fractionation רציפים צעד מרובת יותר מסורתי (איור 3B), רמות היחסי של sarkosyl-לא מסיס קודמן עמילואיד חלבון (APP), טאו (MAPT), ribonucleoprotein גרעיני קטן U1 - 70K (snRNP70) ו אפוליפופרוטאין E (ספקיות) הושוו על ידי פרוטאומיקס ספקטרומטר מסה ללא תווית (MS) מבוסס על פני במאגר שליטה (Ctl), ליקוי קוגנטיבי מתון (MCI) ו- AD במקרים קודמים מחקרים7,18 (איור 3). מדידות של דטרגנט-לא מסיס APP מייצג באופן יעיל את Aβ פפטיד, כמו כל פפטידים APP באופן מלא tryptic לכמת ממופה באזור Aβ של חלבון שאריות APP7אורך מלא 695. עם שתי השיטות, רמות sarkosyl-לא מסיס כל ארבעת החלבונים פיפטות trended כלפי מעלה במקרים MCI ו- AD ביחס פקדים, בקנה אחד עם קורלציה חזקה של ירידה קוגניטיבית, נטל פתולוגי. בסך הכל, העשרה של חלבונים אלו בחלקים דטרגנט-לא מסיס (P2) היו עקביות במידה ניכרת באמצעות צעד אחר צעד18 והן fractionation צעד מרובת פרוטוקולים7.
עם זאת, ישנם הבדלים קלים בין שני למתודולוגיות שיוכיחו יתרון או ומזיקות בהתאם טיבו המדויק ואת המטרות של ניסוי בודדות. נתונים השוואתיים פרוטיאומיה מבנית מסוכמות באיור 3 יכול לעדכן את הפרוטוקול בהתאם לפרמטרים ניסיוני ויישומים. כפי שניתן לצפות, יש פשרה כללי בין מדגם העשרה וטוהר, עם פרוטוקול fractionation מפושטת מנקר יותר מועשר דגימות עם פחות אובדן חלבון מאשר שיטת רב שלבי.
לדוגמה, שליטה שברים לא מסיסים שהוכנו באמצעות פרוטוקול מפושטת (איור 3 א) להפגין מעט גבוה יותר רמות הרקע של חלבונים מחלות רלוונטיות יותר מאלה להכין אותה באמצעות הגישה רב שלבי. לעומת זאת, הטכניקה fractionation צעד בודד יכול להיות יתרון נמוך-שפע חלבונים כמו המדגם הכולל הפסדים מופחתים משמעותית. לדוגמה, העשרת היחסי של sarkosyl-לא מסיס ספקיות במקרים MCI גבוה משמעותית בחלקים לא מסיסים שהוכנו באמצעות פרוטוקול מקוצר (איור 3א).
למרות שתי הגישות הן מספקות יותר להתבונן בכל עלייה משמעותית אגרגטים חלבון misfolded מחלות רלוונטיות או פיפטות, רבים יותר fractionation נרחב והשלבים שטיפה של הגישה צעד מרובת וייתכן שיפיק את מנקה החתימה פרוטיאומיה מבנית יותר ספציפי. עם זאת, הנתונים שלנו לוודא בשיטת צעד אחר צעד fractionation בקנה אחד עם הממצאים שפורסמו כי אגרגטים פיפטות כגון קשרים neurofibrillary טאו (NFTs), שלטי Aβ scrapie prions (PrSc) הם מסיסים ב- sarkosyl, בעוד מקביליהם מקורי מקופל להישאר מסיסים. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
על-ידי חישוב על הסכומים היחסיים של חלבון למחיצות לתוך שברים דטרגנט-לא מסיס של שליטה (n = 3) ו- AD (n = 3) מוח (טבלה 2), רק ~ 10% מהסל חלבון הכולל הוא sarkosyl-לא מסיס. כאשר החלבון הכולל 5 מ"ג של המוח homogenate (ה-S) הוא fractionated, 10.4% ו- 11.3% פרוטאום מחיצות לתוך השבר דטרגנט-לא מסיס הבקרה ואת המקרים לספירה, בהתאמה. הסכום הכולל של sarkosyl-לא מסיס החלבון מועשר במוח לספירה אמנם גבוה מעט יותר שליטה, אין הבדלים משמעותיים נצפו על פני שתי הקבוצות (p = 0.703). אפשרות זו מציינת כי חלבון misfolding, צבירת הוא לא נפוץ במוח לספירה, אבל די מוגבל לקבוצת משנה צר וספציפי של חלבונים כגון טאו, Aβ ו- U1 snRNPs. 7 , 21 , 22
איור 1: ערכת fractionation Sarkosyl. המוח האנושי לאחר המוות (א) א היה הומוגני במאגר מלח נמוכה, אחרי אשר sarkosyl NaCl היו הוסיף ריכוזי הסופי של 1% w/v ו- 0.5 מ', בהתאמה ואת הדגירה למשך 15 דקות על קרח. לאחר sonication, homogenates היו fractionated על ידי ultracentrifugation ב 180,000 x g למשך 30 דקות מנקר את תגובת שיקוע sarkosyl מסיסים (S1), בגדר sarkosyl-לא מסיס (P1). בגדר P1 נשטף (אופציונלי) עם סארק-buffer, re-sedimented על ידי ultracentrifugation לממן בגדר sarkosyl-לא מסיס הסופי (P2). זה שבר P2 היה solubilized במאגר אוריאה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו 3 x 5 s sonication גשש microtip נקי. חלבונים (B) (20 µg) של ה-S, S1, S2 (10 µL) ו- P2 שברים שנפתרו על ידי עמודים מרחביות, קבוע למשך 15 דקות Coomassie מאגר מקבע כחול ולאחריו מכתים עדין עם מאגר מוכתמים G-250 Coomassie מבריק כחול בטמפרטורת החדר למשך הלילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: העשרה של phosphorylated-טאו בשבריר לא מסיסים דטרגנט המוח AD- (A ו ב) חלבון (40 μg) של הסכום הכולל (ה-S), מסיס (S1) ושברים לא מסיסים (P2) היו מחק עם נוגדן נגד טאו phosphorylated ב תראונין 231 (pT231) או AT8 (pSer202, pThr205) כדי להדגים את העשרת של מינים פיפטות פוספו-טאו שבר לא מסיסים (P2) של המוח לספירה. במוח לספירה, משקל מולקולרי גבוה המצטברים טאו באופן בלעדי מחיצות לתוך השבר (P2) אבקת-לא מסיס. (ג) EEA1 שימש סמן חלבון מסיס ושליטה העמסה יחסית עבור סך (ה-S) ו שברים מסיסים (S1) של שליטה והמוח לספירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח פרוטיאומיה מבנית של חלבונים לספירה פיפטות באמצעות פרוטוקול צעד יחיד או רב שלבי fractionation. רמות היחסי של החלבונים sarkosyl-לא מסיס נציג APP (Aβ), טאו, snRNP70 (U1 - 70K), ספקיות מעבר מחלות שונות בין איחדו שליטה, MCI לספירה במקרים באמצעות צעד בודד () או sarkosyl רב שלבי (B) הגישה fractionation. עבור שני datasets, רמת חלבון הוערך על ידי פפטיד ספקטרלי התאמות (PSMs) של אלה זוהו חלבונים ולאחר מנורמל להגדיר המרבי ל- 100. PSMs מן המקרים שליטה, MCI ו- AD (n = 5 כל) שימשו את ערכת הנתונים יחיד-set. עבור הגישה רב שלבי, PSMs של שתי בריכות שכפל השליטה, MCI במקרים לספירה (n = 5 כל) נותחו. קווי שגיאה מציינים את הערכים של זאת אומרת ± S.E.M. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| 10% w/v sarkosyl פתרון: 10 גרם N-לאוריל-sarcosine נתרן מלח לכל 100 מיליליטר ddH2O (stir ב RT למשך הלילה) |
| מאגר מלח נמוכה (LS): 50 מ מ HEPES pH 7.0, סוכרוז 250 מ מ, EDTA 1 מ מ |
| מאגר Sarkosyl (סארק): האם מאגר + 1% (w/v) sarkosyl + 0.5 M NaCl |
| מאגר אוריאה (החנות ב-20 ° C): 50 מ מ טריס-HCl pH 8.5, אוריאה 8 מ', 2% מרחביות |
| 4 X מרחביות טעינת מאגר: 200 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, גליצרול 40%, 8% נתרן dodecyl suflate (מרחביות), 0.4% bromophenol כחול (BPB) ו- 20 מ מ TCEP pH 7.0 ddH2O |
| מאגר מקבע Coomassie: 40% מתנול, 10% חומצה אצטית ddH2O |
| מאגר מוכתמים G-250 Coomassie כחול מבריק: 25% מתנול, חומצה אצטית 5%, 0.1% coomassie כחול G-250 ddH2O |
| Coomassie destain מאגר: 25% מתנול, חומצה אצטית 5% ב- ddH2O |
| 1 X Tris buffered תמיסת מלח (TBS): 50 מ מ טריס-HCl pH 7.45, 150 מ מ NaCl ב- ddH2O |
| 1 X Tris buffered תמיסת מלח עם Tween 20 (TBS/T): 50 מ מ טריס-HCl pH 7.45, 150 מ מ NaCl, 0.1% Tween ddH בתוך 202O |
| 1 X חסימת מאגר (BB): 50 מ מ טריס-HCl pH 7.45, 150 מ מ NaCl, החלבונים 1% (ראה רשימה), 750 מ"מ Methylchloroisothiazolinone ddH2O |
| 1 X חסימת מאגר עם 0.05% Tween 20 (BB/T): 50 מ מ טריס-HCl pH 7.45, 150 מ מ NaCl, החלבונים 1% (ראה רשימה), 0.05% Tween 20, 750 מ מ Methylchloroisothiazolinone ddH2O |
טבלה 1: רשימת מאגרים.
| מדגם | נפח דגימה (µL) | ריכוז (µg/µL) | סה כ חלבון (µg) | חלבון הכולל ממוצע (µg) ו- S.E.M. | % ה-S (5 מ ג) |
| 1 רשימת אישורים אמינים | 70 | 9.89 | 692.3 | ||
| 2 רשימת אישורים אמינים | 70 | 7.38 | 516.6 | 518.7 (±99.63) | 10.4% |
| 3 רשימת אישורים אמינים | 70 | 4.96 | 347.2 | ||
| 1 לספירה | 70 | 9.77 | 683.9 | ||
| 2 לספירה | 70 | 6.67 | 466.9 | 567.0 (±63.20) | 11.3% |
| 3 לספירה | 70 | 7.86 | 550.2 |
טבלה 2: כמות חלבון בחלקים sarkosyl-לא מסיס (P2). בממוצע, האחוז של חלבון זה מחיצות לתוך השבר sarkosyl-לא מסיס השליטה (n= 3) ו- AD (n= 3) המוח היה 10.4% ו- 11.3%, בהתאמה. היה הבדל משמעותי סטטיסטית של כמות חלבונים sarkosyl-לא מסיס של שליטה והמוח לספירה, כפי שמעידים על ידי הסטודנט t-מבחן (p = 0.703), שגיאת תקן של הערכים אומר (S.E.M.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בזאת אנו להציג ולדון פרוטוקול דטרגנט-fractionation צעד אחר צעד מקוצר הרלוונטיים למגוון רחב של יישומים ניסיוני ועד ניתוח פרוטאומיקס מסה ספקטרומטר מבוססי חלבונים פונקציונליים misfolding מבחני אפילו השחרת המערבי. 5 , 6 , 7 , 10 מתודולוגיה זו היא אולי הכי יעיל כאשר נעשה שימוש כדי ללמוד proteinopathies ניווניות כגון אלצהיימר, ALS, מחלת הנטינגטון, פריון ומחלות של tauopathies שונים. בהשוואה לפרוטוקול fractionation רציפים חמשת השלבים המקוריים, הליך זה צעד בודד ניתן להשלים ביום אחד, ונותנת לו תוצאות דומות מאוד. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא השימוש של sarkosyl הנוזל fractionation. לעומת אחרים חומרי ניקוי כמו טריטון X-100 או נתרן dodecyl סולפט (מרחביות) sarkosyl שנראה מתאימה לפעילות זו; לכתחילה, solubilizing הכוח, הוא מספיק חזק כדי solubilize הרוב המכריע של חלבונים מקופלים מקורי תוך שמירה על חומר ניקוי-insolubility, המבנה והתפקוד של אגרגטים חלבון מחלות רלוונטיות כי הם מטבעם רגיש מרחביות. 5 , 9 . בנוסף, בניגוד מרחביות, sarkosyl נשאר מסיס בטמפרטורות נמוכות, בתנאי מלח גבוהה.
תכונת מפתח נוספת של פרוטוקול זה הוא resuspension של sarkosyl-לא מסיס הראשון (P1) כדורי בעקבות הראשון של ultracentrifugation. שלב זה שטיפת מאפשר את כדורי הראשונית (P1) ביסודיות חילוץ, שטף של כל צלב-מזהם שיורית חלבונים מסיסים או על סכום homogenate, מנקר שבריר חלבון דטרגנט-לא מסיס טהור ומוגדר היטב. ללא השלב resuspension ושטוף צניפה אופציונלי (P1), חלבונים מסיסים שיורית עלול להיות נשא-כבר נהיה השבר דטרגנט-לא מסיס, ואולי משתנה מתערב תוצאות עוקבות וניסויים (דהיינו ניתוח immunoblotting או פרוטאומיקס).
הטבע לא מסיסים וגבוה משקל מולקולרי של חלבונים misfolded פיפטות אגרגטים (קרי טאו, פוספו-טאו, זן Aβ) נוכח אתגרים ייחודיים לכיוון שלהם בידוד וניתוח באמצעות טכניקות מסורתיות הביוכימי. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 בניגוד חלבונים מסיסים, לא מסיס אגרגטים כגון amyloids (Aβ) ולא hyperphosphorylated טאו neurofibrillary קשרים (NFTs) ניתן בקלות מטוהרים מרקמות לאחר המוות על ידי שיטות מסורתיות כגון immunoprecipitation או מהר חלבון כרומטוגרפיה נוזלית (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 . וכך, לפרוטוקול sarkosyl מקוצרת-fractionation הוא אחד של טכניקות היחיד המאפשר העשרה נתיישב ובידוד של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח לאחר המוות בתוך יחסית קצר-מסגרת זמן. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
בזמן יכול להיות מועסק צעדים נוספים כדי לבודד מדגם טהור, הומוגני של חלבון צבור, פרוטוקול fractionation sarkosyl מאפשר העשרת נתיישב של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס עם התחייבות זמן יחסית קטנה. 5 , 6 כדי לתמוך בהשערה זו, מחקרים פרוטיאומיה מבנית של פרוטאום sarkosyl-לא מסיס מאשרים כי הרוב המכריע של חלבונים צבירת נוטה פיפטות ידוע למחיצות לתוך sarkosyl-לא מסיס בשבר בשני צעד מרובת מסורתי 6 , 11 , 21 , כמו גם הגישה שלנו הרומן fractionation צעד אחר צעד. 5 , 7 , 9 , 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים ד"ר ג'ים בורסי, אלן Levey, היחידה לנוירולוגיה של אמורי, על הערות מועילות והצעות. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האצת שותפות רפואה המענק (U01AG046161-02), אמורי האלצהיימר של מרכז המחקר של המחלה (P50AG025688) ואת הלאומי להזדקנות הענק (R01AG053960-01) ל- N.T.S. מחקר זה גם נתמך בחלקה על ידי הגרעין Neuropathology של המענק אמורי Neuroscience NINDS הליבה מתקנים, P30NS055077.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al.
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
