Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion
Summary
Hier presenteren we een protocol voor live imaging van muis secundaire paletfusie met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan fluorescerende reporter muis lijnen, en met pathway inhibitors voor mechanistisch inzicht. Dit protocol kan aangepast worden voor livebeelden in andere ontwikkelingssystemen.
Abstract
De fusie van de secundaire palatale planken om het intacte secundaire verhemelte te vormen is een belangrijk proces bij zoogdierenontwikkeling en de verstoring ervan kan leiden tot gespleten secundair verhemelte, een gemeenschappelijke aangeboren afwijking bij mensen. Secundaire smaakfusie is uitgebreid bestudeerd, wat leidt tot verschillende voorgestelde cellulaire mechanismen die dit proces kunnen bemiddelen. Deze studies zijn echter meestal uitgevoerd op vaste embryonale weefsels bij progressieve tijdstippen tijdens de ontwikkeling of in vaste explantieve culturen die zijn geanalyseerd op statische tijdstippen. Statische analyse is beperkt voor de analyse van dynamische morfogenetische processen, zoals een gomfusie en welke soorten dynamische cellulaire gedragingen palatal fusie bemiddelen is onvolledig begrepen. Hier beschrijven we een protocol voor livebeelden van ex vivo secundaire paletfusie in muisembryo's. Voor het onderzoeken van cellulaire gedragingen van verhemeltefusie werd epitheliale-specifieke Keratin14- cre gebruikt om palaatepitheliale cellen in ROS te labelenA26-mTmG flox reporter embryo's. Voor het visualiseren van filamenteactine werden Lifeact-mRFPruby- reportermuizen gebruikt. Live beeldvorming van secundaire verhemelingsfusie werd uitgevoerd door dissecteren van recent gehandhaafde secundaire palatale planken van embryonale dag (E) 14.5 stadium embryo's en culturen in agarose bevattende media op een glasbodemschotel om beeldvorming met een omgekeerde confocale microscoop mogelijk te maken. Met behulp van deze methode hebben we een verscheidenheid aan nieuwe cellulaire gedragingen ontdekt tijdens secundaire paletfusie. Een waardering voor het onderscheidend gedrag van de cellen in ruimte en tijd draagt bij aan ons inzicht in dit dynamische morfogenetische proces. Dit protocol kan worden toegepast op mutante muislijnen, of culturen die worden behandeld met farmacologische remmers om verder te begrijpen hoe secundaire paletfusie gecontroleerd wordt.
Introduction
Weefselfusie is een belangrijke stap in de ontwikkeling van meerdere organen. Grote menselijke geboorteafwijkingen zoals gespleten lip en verhemelte, spina bifida en misvormingen van het hart kunnen het gevolg zijn van gebreken in weefselfusie 1 . Muis secundaire palet fusie is uitgebreid bestudeerd om de cellulaire en moleculaire mechanismen die weefselfusie in ontwikkeling 2 , 3 , 4 bepalen, te identificeren. In de muis begint secundaire paletontwikkeling bij ongeveer E11.5 met de uitgroei van een secundaire palatale plank uit elk van de bilaterale maxillaire processen. De initiële groei van de palatale planken vindt verticaal langs de tong plaats, tot ongeveer E14.0, op dat moment worden de palatale planken horizontaal boven de tong verhoogd. Mediaal gerichte groei resulteert in fysiek contact tussen de toepassende epithelia van de twee palatale planken, waardoor de middelste epithelie vormtAl Seam (MES) op E14.5. De tussenliggende MES moet verwijderd worden tussen de secundaire palatale planken om mesenchymale samenvloeiing mogelijk te maken en de ontwikkeling van een intact, volledig gesmolten secundair verhemelte door E15.5 3 te ontwikkelen .
Hoe is een gedeelde epitheliale MES cellaag gevormd tussen twee afzonderlijke palatale planken, en vervolgens verwijderd om mesenchymale samenvloeiing te bereiken, is een centrale vraag in de ontwikkeling van de verhemelte. Gebaseerd op histologische en elektronenmicroscopie (EM) studies, explorante cultuurstudies en functionele muisgenetische experimenten, zijn er in dit proces verschillende fundamentele celgedragen betrokken. Filopodia-achtige projecties van het mediale randepitheel MEE van elke palatale plank vergemakkelijkt het eerste contact 5 , 6 , gevolgd door intercalatie van deze epitheliale cellen naar een gedeelde single MES 6 , 7 . Verwijdering van de resulterende gedeelde MESIs voorgesteld om door drie niet-exclusieve mechanismen te gaan. Vroege studies waarbij histologische observaties en ex vivo lijnsporen met vitale kleurstoffen werden gebruikt, wijzen erop dat het MES kan worden verwijderd door epitheliale tot mesenchymale overgang (EMT) van MES-cellen 8 , 9 , alhoewel recentere genetische afstamming van epitheliale cellen onzekerheid heeft opgedaan met betrekking tot De langetermijnbijdrage van epitheelcellen aan de palatale plank mesenchymme 10 , 11 , 12 . Significante aantallen apoptotische cellen, en een vermindering van hun aantal in sommige mutanten die geen goede palatefusie ondergaan, heeft geleid tot het idee dat apoptose een belangrijke aandrijving van MES-oplossing 2 , 3 kan zijn . Ten slotte, oorspronkelijk gebaseerd op studies met epitheliale etikettering en statische observatie bij progressieve tijdpunten, MES-cellenWerden voorgesteld om te migreren in de oronasale en anteroposterior afmetingen 11 , 13 , maar dergelijke dynamische celgedragen waren aanvankelijk onbevestigd doordat ze niet in staat waren om ze in levend palatale weefsel te observeren. Onlangs waren we in staat om deze gedragingen direct te observeren door een nieuwe live imaging methodologie te ontwikkelen die muisgenetische methoden van fluorescerende etikettering combineert met confocale livebeelden van explanted palatale planken.
Ten eerste, voor het visualiseren van dynamisch cellulair gedrag in gomepitheelcellen tijdens de gomfusie , genereren we een epitheliale-specifieke reportermuis door ROSA26-mTmG floxmuizen met Keratin14-cre muizen 14 , 15 te oversteken. Confocale levende beeldvorming van de verhemelte-explorante cultuur van de resulterende embryo's bevestigde een aantal eerder voorgestelde cellulaire gedragingen en geïdentificeerde nieuwe gebeurtenissen in het fusieproces 6 </sup>. Epitheliale celmembraan uitsteeksels voorafgegaan aan initieel cel-celcontact gevolgd door epitheelconvergentie door celintercalatie en oronasale celverplaatsing. In het bijzonder ontdekten we dat cel extrusie, een proces dat belangrijke rollen speelde in epitheliale homeostase, een belangrijk mechanisme was om muis secundaire paletfusie 6 , 16 te beheren. Deze beeldvormingsmethode kan gebruikt worden bij andere reporterlijnen; We hebben Lifeact-mRFPruby transgene muizen 17 , 18 gebruikt om actin cytoskeletale dynamiek te onderzoeken tijdens het fusieproces. Andere verslaggevers kunnen ook worden gebruikt om andere specifieke aspecten van verhemeltefusie te observeren en deze methode kan worden aangepast aan laserscanning-confocal microscopie of draaibare confocal microscopie, afhankelijk van beeldbehoeften en beschikbaarheid van microscoop. Live imaging wordt steeds meer een keystone-aanpak in ontwikkelingsbiologie. PartiCulariofaciale morfogenese is complex en menselijke geboorteafwijkingen die het gezicht beïnvloeden zijn gebruikelijk. Deze confocal live imaging methode zal bijdragen tot een beter inzicht in onderliggende basisontwikkelingsmechanismen, alsmede de oorsprong van menselijke craniofaciale afwijkingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Live beeldvorming van weefselmorfogenese met 3D-organische explantatiecultuur kan gedetailleerde informatie verschaffen over cellulaire processen die niet kunnen worden aangetoond in conventionele kleuranalyse van vaste weefselsecties. Met behulp van in vitro explant cultuur van muis embryonale secundaire verhemelte, we observeren verschillende interessante cellulaire gedragingen die ons leiden tot een nieuw mechanisme van verhemelte fusie die epitheliale convergentie en cel extrusie omvat.
<p class="jove_c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken M. Douglas Benson voor de eerste gesprekken over secundaire paletbeelden. We erkennen ook David Castaneda-Castellanos (Leica) en Chris Rieken (Zeiss) voor hun hulp om beeldvormende omstandigheden in confocale microscopie aan te passen. We waarderen Lynsey Hamilton (Bitplane) voor nuttige suggesties voor kwantitatieve beeldanalyse met behulp van Imaris-software. Dit werk werd gefinancierd door NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion – where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O’Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -. Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
