הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז 'ן
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך העכבר העכבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal. פרוטוקול זה ניתן להשתמש בשילוב עם מגוון רחב של שורות העכבר כתב פלואורסצנטי, עם מעכבי נתיב עבור תובנה מכניסטית. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור הדמיה חיה במערכות התפתחותיות אחרות.
Abstract
ההיתוך של המדפים הפלטליים המשניים כדי ליצור את החיך המשני השלם הוא תהליך מפתח בהתפתחות יונקים והפרעותיו יכולות להוביל לחיך משני שסוע, אנומליה מלידה נפוצה אצל בני אדם. מיצוי החיך המשני נחקרה בהרחבה ומובילה למספר מנגנונים סלולריים מוצעים שעשויים לתווך את התהליך. עם זאת, מחקרים אלה בוצעו בעיקר על רקמות עובריים קבוע בשעה timepoints פרוגרסיבי במהלך הפיתוח או בתרבויות explant קבוע ניתח על נקודות זמן סטטיות. ניתוח סטטי מוגבל עבור ניתוח של תהליכים מורפוגנטיים דינמיים כגון היתוך החיך ואילו סוגים של התנהגויות הסלולר דינמי לתווך היתוך palatal אינו מובן לחלוטין. כאן אנו מתארים פרוטוקול הדמיה חיה של היתוך חיך vivo לשעבר משני עוברים עכבר. כדי לבחון התנהגויות הסלולר של היתוך החיך, אפיתל ספציפי קראטין 14-Cre שימש התווית חיך אפיתל תאים ב ROSA26-mTmG עובר לכתב flox. כדי להמחיש אקטין נימי, עכברים LifeACT-mRFPruby כתב שימשו. הדמיה חיה של היתוך החיך המשניים בוצעה על ידי לנתח לאחרונה מדבקות paltal משני דבקו של היום עובריים 14.5 שלב ו culturing ב המכילים agarose התקשורת על צלחת תחתית זכוכית כדי לאפשר הדמיה עם מיקרוסקופ confocal הפוך. באמצעות שיטה זו, גילינו מגוון רחב של התנהגויות הסלולר הרומן במהלך היתוך החיך המשני. הערכה של התנהגויות תאים ברורים מתואמים בחלל ובזמן תורמת רבות להבנתנו את התהליך המורפוגנטי הדינמי הזה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על עכבר מוטציה קווים, או תרבויות שטופלו מעכבי פרמקולוגי כדי לקדם את ההבנה מראש של איך פיוזון החיך המשני נשלטת.
Introduction
היתוך רקמות הוא צעד חשוב בפיתוח של איברים מרובים. מומים מולדים אנושיים עיקריים כגון שפה שסועה וחך, ספינה ביפידה ומומים של הלב יכולים לנבוע מליקויים בהרכב רקמות 1 . עכבר חך היתוך משני כבר למד בהרחבה כדי לזהות את המנגנונים המולקולריים הסלולר השליטה היתוך רקמות בפיתוח 2 , 3 , 4 . בעכבר, פיתוח החיך המשני מתחיל סביב E11.5 עם תולדה של מדף palatal משני מכל אחד התהליכים הבילטראליים דו צדדי. הגידול הראשוני של המדפים paltal מתרחשת אנכית לאורך הלשון, עד E14.0 בערך, אז, המדפים paltal להיות מורם אופקית מעל הלשון. תוצאות רפואיות מכוונות מבחינה רפואית במגע פיזי בין אפיתל ההטיה של שני המדפים הפאלטליים, המרכיבים את האפיתלי של קו האמצעאל תפר (MES) ב E14.5. MES המתערב יש להסיר בין המדפים paltal משני כדי לאפשר מפגש mesenchymal ופיתוח של החיך המשני שלם, התמזגו לחלוטין על ידי E15.5 3 .
איך משותף אפיתל תא MES שכבת נוצר בין שני מדפים נפרדים paltal, ולאחר מכן הוסר כדי להשיג confluency mesenchymal, כבר שאלה מרכזית בפיתוח החיך. בהתבסס על מחקרים מיקרוסקופיים של עכברים ומיקרוסקופים אלקטרומגנטיים (EM), מחקרי תרבות אקספאנטיים וניסויים פונקציונליים של גנטיקה של עכברים, מספר התנהגויות תא בסיסיות היו מעורבים בתהליך זה. פילופודיה כמו תחזיות מן האפיתל קצה המדיאלי MEE של מדף כל palatal מאפשר מגע ראשוני 5 , 6 , ואחריו intercalation של תאים אלה אפיתל משותף MES 6 , 7 . הסרת MES המשותף שהתקבלהוצע להמשיך בשלושה מנגנונים לא בלעדיים. מחקרים מוקדמים המעסיקים תצפיות היסטולוגיות ושושלת אקסו vivo עוקבים אחר צבעים חיוניים הצביעו על כך שה- MES יכול להיות מוסר על ידי אפיתל ל- mesenchymal transtemal (EMT) בתאי MES 8 , 9 , אם כי לאחרונה, מעקב גנטי אחר של תאי אפיתל העלה את אי-הוודאות לגבי התרומה ארוכת הטווח של תאים אפיתל המדף palesalyme 10 , 11 , 12 . מספר משמעותי של תאים אפופטוטיים, וכן ירידה במספר מוטציות מסוימות שלא מצליחים לעבור היתוך החיך הנכון הוביל לרעיון כי אפופטוזיס עשוי להיות נהג מרכזי של MES פירוק 2 , 3 . לבסוף, מבוסס בתחילה על מחקרים מעורבים תיוג אפיתל תצפית סטטית ב timepoints פרוגרסיבי, תאים MESהוצעו להגר בממדים 11 ו -13 , 13 , 13 , אך התנהגויות תא דינמיות כאלה לא אושרו בתחילה בשל חוסר היכולת להתבונן בהן ברקמה חיה. לאחרונה, הצלחנו לבחון באופן ישיר את ההתנהגויות הללו על ידי פיתוח מתודולוגיה חדשה של הדמיה חיה המשלבת שיטות גנטיות עכבר של תיוג פלואורסצנטי עם הדמיה חיה confocal של מדפים paltal explanted.
ראשית, כדי לחזות התנהגויות הסלולר דינמיות בתאי האפיתל חיך במהלך היתוך חיך, יצרנו עכבר עיתונאי ספציפי האפיתל על ידי חציית ROSA26-mTmG עכברי flox עם Keratin14-Cre עכברי 14, 15. Confocal הדמיה חיה של החיך explant התרבות של העוברים שהתקבלו אישר כמה התנהגויות הסלולר הציע בעבר זיהו אירועים רומן בתהליך היתוך 6 </22pl אפיתל בליטות הממברנה התא קדמו קשר תא תא ראשוני ואחריו התכנסות אפיתל ידי intercalation התא ו תזוזה תא אורונצלי. ראוי לציין, גילינו גם כי שחול התא, תהליך דיווחו לשחק תפקידים חשובים בהומיאוסטזיס אפיתל, היה מנגנון מרכזי נהיגה חיך העכבר החיך המשני 6 , 16 . שיטה זו הדמיה ניתן להשתמש עם שורות כתב אחרים; אנו ניצלו Lifeact-mRFPruby עכברים מהונדסים 17 , 18 לבחון את הדינמיקה cytoskeletal אקטין במהלך תהליך היתוך. כתבים אחרים יכולים לשמש גם כדי לבחון היבטים ספציפיים אחרים של היתוך החיך ואת שיטה זו ניתן להתאים גם לייזר מיקרוסקופ סריקה מיקרוסקופית או ספינינג דיסק confocal, בהתאם לצרכים הדמיה וזמינות מיקרוסקופ. הדמיה חיה הופכת יותר ויותר לגישה של קיסטון בביולוגיה התפתחותית. Partiבאופן חלקי, מורפוגנזה craniofacial מורכבת ומומים מולדים אנושיים המשפיעים על הפנים הם נפוצים. שיטה זו הדמיה חיה confocal יעזור לאפשר הבנה משופרת של מנגנוני התפתחות בסיסיים הבסיסית כמו גם מקורות של הפרעות craniofacial האדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיה חיה של morphogenesis רקמות עם 3D תרבות explant איבר יכול לספק מידע מפורט לגבי תהליכים תאיים כי לא ניתן להציג ניתוח מכתים קונבנציונלי של קטעי רקמה קבועה. שימוש בתרבות explant חוץ גופית של החיך העכברי העכבר העכבר, ראינו כמה התנהגויות הסלולר מעניין מוביל אותנו להציע מנגנון …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למ 'דאגלס בנסון לשיחות ראשוניות בנושא הדמיה משנית של החיך. כמו כן, אנו מודים דוד Castandeda-Castellanos (לייקה) וכריס Rieken (Zeiss) על עזרתם כדי להתאים את תנאי הדמיה במיקרוסקופ confocal. אנו מעריכים את Lynsey Hamilton (Bitplane) להצעות מועילות לניתוח תמונות כמותי באמצעות תוכנת Imaris. עבודה זו מומנה על ידי NIH / NIDCR R01 DE025887.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -. Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion – where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birth defect. Acta Histochem. 109, 1-14 (2007).
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139, 231-243 (2012).
- Lan, Y., Xu, J., Jiang, R. Cellular and Molecular Mechanisms of Palatogenesis. Curr Top Dev Biol. 115, 59-84 (2015).
- Taya, Y., O’Kane, S., Ferguson, M. W. Pathogenesis of cleft palate in TGF-b3 knockout mice. Development. 126, 3869-3879 (1999).
- Kim, S., et al. Convergence and Extrusion Are Required for Normal Fusion of the Mammalian Secondary Palate. PLOS Biol. 13, 100122 (2015).
- Yoshida, M., et al. Periderm cells covering palatal shelves have tight junctions and their desquamation reduces the polarity of palatal shelf epithelial cells in palatogenesis. Genes Cells. 17, 455-472 (2012).
- Fitchett, J., Hay, E. Medial edge epithelium transforms to mesenchyme after embryonic palatal shelves fuse. Dev. Biol. 131, 455-474 (1989).
- Akira, N., et al. The expression of TGF-beta3 for epithelial-mesenchyme transdifferentiated MEE in palatogenesis. J Mol Hist. 41, 343-355 (2010).
- Sani, F. V., et al. Fate-mapping of the epithelial seam during palatal fusion rules out epithelial-mesenchymal transformation. Dev. Biol. 285, 490-495 (2005).
- Jin, J. -. Z., Ding, J. Analysis of cell migration, transdifferentiation and apoptosis during mouse secondary palate fusion. Development. 133, 3341-3347 (2006).
- Xu, X., et al. Cell autonomous requirement for Tgfbr2 in the disappearance of medial edge epithelium during palatal fusion. Dev. Biol. 297, 238-248 (2006).
- Carette, M. J., Ferguson, M. W. The fate of medial edge epithelial cells during palatal fusion in vitro: an analysis by Dil labelling and confocal microscopy. Development. 114, 379-388 (1992).
- Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Dassule, H., Lewis, P., Bei, M., Mass, R., McMahon, A. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127, 4775-4785 (2000).
- Eisenhoffer, G., et al. Crowding induces live cell extrusion to maintain homeostatic cell numbers in epithelia. Nature. 484, 501-546 (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Riedl, J., et al. Lifeact mice for studying F-actin dynamics. Nat Methods. 7, 168-169 (2010).
- Can, A., et al. Attenuation correction in confocal laser microscopes: a novel two-view approach. J Microsc. 211, (2003).
- Veenman, C., Reinders, M., Backer, E. Resolving motion correspondence for densely moving points. IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell. 23, 54-72 (2001).
- Udan, R., Piazza, V., Hsu, C., Hadjantonakis, A., Dickinson, M. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141, 4406-4414 (2014).
- Stoller, J., et al. Cre reporter mouse expressing a nuclear localized fusion of GFP and beta-galactosidase reveals new derivatives of Pax3-expressing precursors. Genesis. 46, 200-204 (2008).
