Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

Summary

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging in diretta di fusione secondaria del palato del mouse usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con una varietà di linee fluorescenti del mouse del reporter, e con inibitori del percorso per l'intuizione meccanica. Questo protocollo può essere adattato all'immagine dal vivo in altri sistemi di sviluppo.

Abstract

La fusione degli scaffali palatali secondari per formare il palato secondario intatto è un processo chiave nello sviluppo mammifero e la sua rottura può portare a palato secondario, una comune anomalia congenita negli esseri umani. La fusione secondaria del palato è stata ampiamente studiata portando a diversi meccanismi cellulari proposti che possono mediare questo processo. Tuttavia, questi studi sono stati eseguiti principalmente su tessuti embrionali fissi a tempi progressivi durante lo sviluppo o in colture fisse esplorate analizzate a tempi statici. L'analisi statica è limitata per l'analisi di processi morfogenetici dinamici come una fusione di palato e quali tipi di comportamenti cellulari dinamici mediare la fusione palatale è incompleta. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di ex vivo fusione palato secondario in embrioni di topo. Per esaminare i comportamenti cellulari della fusione del palato, la chirurgia Keratin14 specifica epiteliale è stata usata per etichettare le cellule epiteliali del palato in ROSEmbrioni A26-mTmG ^flox reporter. Per visualizzare l'actina filamentosa, sono stati utilizzati topi reattore Lifeact-mRFPruby . L'imaging in vivo di fusione secondaria del palato è stato eseguito dissezionando i ripiani secondari palatali recentemente aderiti di embrioni di fase di embrione (E) 14.5 e coltivando in supporti contenenti agarosio su un piatto di fondo in vetro per consentire l'imaging con un microscopio confocale invertito. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato una varietà di nuovi comportamenti cellulari durante la fusione secondaria del palato. Un apprezzamento di come i comportamenti cellulari distinti sono coordinati nello spazio e nel tempo contribuiscono notevolmente alla nostra comprensione di questo processo morfogenetico dinamico. Questo protocollo può essere applicato alle linee del topo mutante o alle colture trattate con inibitori farmacologici per migliorare ulteriormente la comprensione di come viene controllata la fusione secondaria del palato.

Introduction

La fusione tissutale è un passo importante nello sviluppo di organi multipli. I principali difetti della nascita umana, quali il labbro e il palato, la bifida delle spine e le malformazioni del cuore possono derivare da difetti nella fusione tissutale ¹ . La fusione del palato secondario del mouse è stata ampiamente studiata per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la fusione tissutale nello sviluppo ^{2 , 3 , 4} . Nel topo, lo sviluppo del palato secondario inizia a circa E11.5 con l'espansione di un ripiano secondario palatale da ognuno dei processi bilaterali maxillari. La crescita iniziale degli scaffali palatali si verifica verticalmente lungo la lingua, fino a circa l'E14.0, durante i quali gli scaffali palatari si elevano orizzontalmente sopra la lingua. La crescita medialmente diretta produce un contatto fisico tra l'epiteli apposita dei due ripiani palatari, formando l'epitelio della medianaAl seam (MES) a E14.5. Il MES interveniente deve essere rimosso tra gli scaffali palatali secondari per consentire la confluenza mesenchimale e lo sviluppo di un palato secondario intatto, completamente fuso, da E15.5 ³ .

Come uno strato di cellule MES epiteliale condiviso tra due mensole palatine separate e poi rimosso per ottenere confluenza mesenchimale, è stata una questione centrale nello sviluppo del palato. Sulla base di studi sul microscopio istologico e elettronico del microscopio (EM), sugli studi sulla cultura esplosiva e sugli esperimenti funzionali di genetica del mouse, sono stati implicati diversi comportamenti di cellule fondamentali in questo processo. Le proiezioni simili a filopodie dall'epitelio mediale del bordo MEE di ogni mensola palatina facilitano il contatto iniziale ^{5 , 6} , seguito da intercalazione di queste cellule epiteliali a un singolo MES ^{6 , 7} condiviso. Rimozione della conseguente MES condivisaÈ stato proposto di procedere con tre meccanismi non esclusivi. Gli studi iniziali che impiegavano osservazioni istologiche e tracciamento lineare ex vivo con coloranti vitali indicavano che la MES potrebbe essere rimossa dall'epitelio alla transizione mesenchimale (EMT) delle cellule MES ^{8 , 9} , anche se più recentemente il tracciamento genetico delle cellule epiteliali ha aumentato l'incertezza Il contributo a lungo termine delle cellule epiteliali al mesenchimico palatale ^{10 , 11 , 12} . Un numero significativo di cellule apoptotiche e una riduzione del loro numero in alcuni mutanti che non subiscono una corretta fusione di palato hanno portato all'idea che l'apoptosi può essere un fattore importante della dissoluzione MES ^{2 , 3} . Infine, basata inizialmente su studi che coinvolgono l'etichettatura epiteliale e l'osservazione statica a tempi progressivi, le cellule MESSono stati proposti di migrare nelle dimensioni oronasali e anteroposterior ^{11 , 13} , ma tali comportamenti dinamici di cellule sono stati inizialmente non confermati a causa di una incapacità di osservarli nel tessuto palatale vivo. Recentemente siamo stati in grado di osservare direttamente questi comportamenti sviluppando una nuova metodologia di imaging dal vivo che combina i metodi genetici del mouse con l'etichettatura fluorescente con l'imaging live in confocale di scaffali palatali esplorati.

In primo luogo, per visualizzare i comportamenti cellulari dinamici nelle cellule epiteliali del palato durante la fusione del palato, abbiamo generato un mouse reporter specifico epiteliale attraversando i topi ^flox ROSA26-mTmG con i topi Keratin ¹⁴ -cre ^{14 , 15} . L'imaging in diretta confocale della cultura esplante del palato degli embrioni risultanti ha confermato alcuni comportamenti cellulari proposti in precedenza e ha identificato nuovi eventi nel processo di fusione ⁶ </sup>. Le protuberanze della membrana delle cellule epiteliali hanno preceduto il contatto cellulare iniziale seguito da convergenza epiteliale mediante intercalazione delle cellule e spostamento delle cellule oronasali. Notevolmente, abbiamo anche scoperto che l'estrusione cellulare, un processo segnalato per svolgere ruoli importanti nell'omeostasi epiteliale, è stato un meccanismo importante che porta la fusione dei palati secondari del mouse ^{6 , 16} . Questo metodo di imaging può essere utilizzato con altre linee di reporter; Abbiamo utilizzato i topi transgenici Lifeact-mRFPruby ^{17 , 18} per esaminare le dinamiche citoscheletriche dell'atina durante il processo di fusione. Altri giornalisti possono anche essere impiegati per osservare altri aspetti specifici della fusione di palato e questo metodo può essere adattato sia alla microscopia confocale a scansione laser che alla microscopia confocale del disco di filatura, a seconda delle esigenze di imaging e della disponibilità del microscopio. L'imaging in diretta sta diventando sempre più un approccio fondamentale nella biologia dello sviluppo. PartiLa morfogenesi craniofacialica è complessa e le difese di nascita umane che colpiscono il viso sono comuni. Questo metodo di imaging live in confocale aiuterà a consentire una migliore comprensione dei meccanismi fondamentali di sviluppo fondamentali e delle origini delle anomalie craniofacciali umane.

Protocol

Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità ai protocolli dell'Università della California a San Francisco, istituto di cura e uso degli animali. 1. Preparazione di Media Live Imaging Preparazione di supporti di coltura liquida Aggiungere 20% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 200 μg / mL acido L-ascorbico, 15 mM HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DME…

Representative Results

L'imaging in vivo della cultura esplante del palato ha rivelato molteplici processi cellulari che mediano la fusione dei palati 6 . I contatti iniziali tra due cellule epiteliali sono fatti da protuberanze a membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando due strati epiteliali si incontrano, formano una MES stratificata a più cellule seguita da intercalazione per creare un unico MES a livello cellulare integrato attraverso la…

Discussion

L'imaging in tempo reale della morfogenesi tissutale con la cultura dell'esplosivo dell'organo 3D può fornire informazioni dettagliate sui processi cellulari che non possono essere mostrati in analisi convenzionali di colorazione delle sezioni dei tessuti fissi. Utilizzando la cultura esplante in vitro del palato secondario embrionale del mouse, abbiamo osservato diversi comportamenti cellulari interessanti che ci hanno portato a proporre un nuovo meccanismo di fusione di palato che coinvolge la co…

Materials

Reagents
DMEM/F12	Life technology	11330-032
Fetal Bovine Serum	Life technology	16000-044
L-glutamine	Life technology	25030-081
L-Ascorbic acid	Sigma	A4544-100G
Pennicillin/Streptomycin	Life technology	15140-122
Low melting agarose	BioExpress	E-3111-125
35mm glass bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C
Petrolieum Jelly (Vaseline)	Sigma	16415-1Kg
Mice
Keratin14-cre		MGI: J:65294	Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc
ROSA26mTmG		MGI: J:124702	Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo
Lifeact-mRFPruby		MGI: J:164274	Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows
Microscope
White Light SP5 confocal microscope	Leica Microsystems
Cell Observer spinning disk confocal microscope	Zeiss Microscopy