Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징
Summary
여기, 우리는 공 촛점 현미경을 사용하여 마우스 보조 입천장 융합의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 다양한 형광 기자 마우스 라인과 기계적 통찰력을위한 경로 억제제와 함께 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 발달 시스템의 라이브 이미징에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
2 차 구개 선반이 융합되어 2 차 구개를 형성하는 것은 포유 동물의 발달 과정에서 중요한 과정이며, 그 파열로 인해 인간의 공통 선천성 기형 인 2 차 구개가 생길 수 있습니다. 이차 미각 융합은 광범위하게 연구되어이 과정을 중재 할 수있는 몇 가지 제안 된 세포 메커니즘을 유도한다. 그러나, 이러한 연구는 개발 도중 또는 고정 된 시점에서 분석 된 고정 된 체외 이식편 배양에서 진보적 인 시점에서 고정 배아 조직에서 주로 수행되었다. 정적 분석은 미각 융합과 같은 동적 인 형태 발생 과정의 분석과 어떤 유형의 동적 세포 행동이 구개 융합을 중재 하는지를 불완전하게 이해하는 데에는 한계가있다. 여기 우리는 마우스 배아에서 생체 내 2 차 구개 융합의 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 구개 융합의 세포 행동을 조사하기 위해 상피 특이 적 Keratin14 -cre를 사용하여 ROS의 구개 상피 세포를 표지 하였다A26-mTmG flox 기자 배아. 섬유질 악틴을 시각화하기 위해 Lifeact-mRFPruby 리포터 마우스를 사용했습니다. 이차 구개 융합의 라이브 영상은 배아 일 (E) 14.5 단계 배아의 최근 부착 2 차 구개 선반을 해부하고 거꾸로 공 촛점 현미경으로 이미징을 활성화하기 위해 유리 바닥 접시에 아가로 오스 함유 미디어에서 배양하여 수행되었습니다. 이 방법을 사용하여 우리는 2 차 구개 융합 동안 다양한 새로운 세포 행동을 발견했습니다. 공간과 시간에 어떻게 구별되는 세포 행동이 조정되는지에 대한 감사는 이러한 동적 형태 형성 과정에 대한 우리의 이해에 크게 기여한다. 이 프로토콜은 돌연변이 마우스 라인, 또는 두 번째 구개 융합이 제어되는 방법에 대한 이해를 진전시키기 위해 약리학 적 억제제로 치료 한 배양 물에 적용 할 수 있습니다.
Introduction
조직 융합은 여러 장기의 발달에 중요한 단계입니다. 갈라진 입술과 입천장, 척추이 분증과 심장 기형과 같은 주요 인간의 선천적 결손은 조직 융합의 결함으로 생길 수 있습니다 1 . 마우스 2 차 구개 융합은 개발 2 , 3 , 4 에서 조직 융합을 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 확인하기 위해 광범위하게 연구되었습니다. 마우스에서 2 차 구개 발달은 E11.5에서 시작하여 양측 상악골의 각 단계에서 2 차 구개 선반이 형성됩니다. 구개 선반의 초기 성장은 대략 E14.0까지 혀를 따라 수직적으로 발생하며, 이때 구개 선반은 혀 위에서 수평으로 상승합니다. medially-directed growth는 정중선 epitheli를 형성하면서, 두 개의 구개 선반의 apposing epithelia 사이의 물리적 접촉을 가져온다E14.5에서 MES (al seam). 중간 엽 합병과 E15.5에 의한 완전히 융합 된 2 차 구개의 발생을 허용하기 위해 중간 구개 선반 사이에서 중간 MES를 제거해야합니다 3 .
공유 상피 MES 세포층이 2 개의 분리 된 구개 선반 사이에 형성되고,이어서 중간 엽의 confluency를 달성하기 위해 제거되는 방법은 구개 발달에서 중심적인 문제였다. 마우스 histological 및 전자 현미경 (EM) 연구, explant 문화 연구 및 기능 마우스 유전학 실험을 바탕으로, 몇 가지 기본적인 세포 행동이 과정에 연루되었습니다. 각 선반 구개의 내측 가장자리 상피에서 MEE Filopodia 형 돌기는 공유 단일 MES 6,7 이러한 상피 세포의 인터이어서 초기 접촉 (5, 6)을 용이하게한다. 결과 공유 MES 제거세 가지 비 독점적 인 메커니즘으로 진행하도록 제안되었습니다. 조직 학적 관찰과 중요한 염료로 추적 체외 계보를 사용하는 초기 연구는 MES는 MES 세포의 중간 엽 전환 (EMT)로 상피에 의해 제거 될 수 있습니다 8, 9,하지만 최근, 상피 세포의 유전 적 혈통 추적이에 대한 불확실성을 제기했다고 표시 palatal shelf mesenchyme 10 , 11 , 12 에 대한 상피 세포의 장기적인 기여. 현저한 수의 세포 사멸 세포와 적절한 미각 융합을 거치지 못하는 일부 돌연변이 체에서의 세포 수 감소는 세포 사멸이 MES 용해 2 , 3 의 주요 동인이 될 수 있다는 생각으로 이어진다. 마지막으로, 점진적 시점에서 상피 표지 및 정적 관찰을 포함하는 연구에 기초하여, MES 세포구강 및 전후 치수 11 , 13 에서 이동하는 것이 제안되었지만, 이러한 동적 세포 행동은 초기에 생 구개 조직에서 관찰 할 수 없기 때문에 미확인이었다. 최근 우리는 구강 구강 선별의 공 촛점 라이브 영상과 형광 라벨링의 마우스 유전자 방법을 결합한 새로운 라이브 이미징 방법론을 개발함으로써 이러한 행동을 직접 관찰 할 수있었습니다.
첫째, 구개 융합 동안 구개 상피 세포의 동적 세포 행동을 시각화하기 위해, 우리는 Keratin14-CRE 마우스 14, 15 ROSA26 – mTmG flox 마우스를 교차하여 상피 별 기자 마우스를 생성합니다. 결과 배아의 구개 explant 문화의 공 촛점 라이브 이미징 일부 이전에 제안 된 세포 행동을 확인하고 융합 과정 6 에서 새로운 이벤트를 확인 </sup>. 상피 세포 막 돌출부는 초기 세포 – 세포 접촉에 이어 세포 삽입 및 구강 세포 변위에 의한 상피 수렴이 뒤 따른다. 특히, 우리는 또한 세포 압출, 상피 항상성에 중요한 역할을하는 것으로보고 프로세스를 발견, 마우스 차 구개 융합 (6), (16)를 운전하는 주요 메커니즘이었다. 이 이미징 방법은 다른 기자 회선과 함께 사용할 수 있습니다. 우리는 융합 과정에서 액틴 세포 골격 역학을 검사하기 위해 Lifeact-mRFPruby 형질 전환 마우스 17 , 18 을 사용했습니다. 다른 기자는 또한 구개 융합의 다른 특정 측면을 관찰하는 데 사용할 수 있으며이 방법은 이미징 요구 및 현미경 가용성에 따라 공 촛점 현미경 검사 또는 회전 디스크 공 촛점 현미경 검사에 맞게 조정할 수 있습니다. 생체 영상은 발달 생물학에서 핵심적인 접근 방법이되고 있습니다. 이상적 상대cularly, craniofacial morphogenesis는 복잡하고 얼굴에 영향을 미치는 인간의 선천적 결함은 일반적입니다. 이 공 촛점 라이브 이미징 방법은 인간의 craniofacial 이상의 기원뿐만 아니라 근본적인 기본 발달 메커니즘의 향상된 이해를 활성화하는 데 도움이됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D 장기 explant 문화와 조직 morphogenesis의 라이브 이미징 고정 조직 섹션의 기존 얼룩 분석에 표시 할 수없는 세포 프로세스에 관한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다. 생쥐의 배아 이차 배뇨의 생체 외편 배양 배지를 사용하여 우리는 상피 융합과 세포 압출을 포함하는 구개 융합의 새로운 메커니즘을 제안하기 위해 몇 가지 흥미로운 세포 행동을 관찰했다.
이러한 유?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
2 차 구개 영상에 관한 초기 대화에 M. Douglas Benson에게 감사드립니다. 공 촛점 현미경 검사에서 이미징 조건을 조정하는 데 도움을 준 David Castaneda-Castellanos (Leica)와 Chris Rieken (Zeiss)도 인정합니다. 우리는 Lynsey Hamilton (Bitplane)에게 Imaris 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을위한 유용한 제안을 해주었습니다. 이 작품은 NIH / NIDCR R01 DE025887에 의해 재정 지원을 받았다.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM/F12 | Life technology | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Life technology | 16000-044 | |
| L-glutamine | Life technology | 25030-081 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A4544-100G | |
| Pennicillin/Streptomycin | Life technology | 15140-122 | |
| Low melting agarose | BioExpress | E-3111-125 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Petrolieum Jelly (Vaseline) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc | |
| ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss Microscopy |
References
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