Summary
この記事は、大動脈バルーン傷害の後 myointimal 過形成 (MH) の開発を研究するマウスモデルを示します。
Abstract
動物モデルの使用は、MH、動脈狭窄症の主要な原因の 1 つのより良い理解のために不可欠です。この記事では、大動物で確立された容器損傷モデルに匹敵するマウス バルーン侵食モデルを示しています。バルーン カテーテルを大動脈侵食モデルは臨床設定を模倣し、匹敵する病態と生理学的な変化に 。簡潔に、実行後水平切開腹部大動脈で、バルーンカテーテル、血管に挿入、水増し、逆行性導入します。バルーンのインフレは内膜傷害と容器の overdistension に します。カテーテルを抜去後、大動脈切開は単一 stiches を閉鎖します。この資料に示すモデルは再生可能で、行うには、簡単、迅速かつ確実に確立することができます。特に経済的な方法で適用することができます高価な実験的治療剤の評価に適しています。別のノックアウト マウス系統を用いた MH 開発の別の遺伝子の影響を評価できます。
Introduction
冠動脈および末梢動脈における動脈狭窄患者1の死亡率と罹患率に大きな影響があります。1 つの根本的な病理メカニズムは myointima 過形成 (MH)、増加増殖、移行、および血管平滑筋細胞 (SMC)2からの細胞外マトリックス蛋白質の合成によって特徴付けられる。SMC は容器のメディア層にあり、内腔の表面への刺激に移行します。刺激信号は成長因子、サイトカイン、細胞間連絡、脂質、細胞外マトリックス成分、機械的せん断をストレッチ力3,4,5,6あります。病理学的または医原性、血管壁の損傷血管内皮細胞と平滑筋細胞の損傷を引き起こすと炎症反応を刺激し、MH7につながります。
異なる動物モデルが現在利用できる myointima 増殖症動脈損傷を研究です。豚のような大型の動物や犬共有同様の動脈と冠動脈解剖学人間の利点を持っているし、特に血管形成技術、手順、およびデバイス8を調査し研究に適しています。ただし、豚モデルは、犬のみが軽度の血管傷害11レスポンス高い血栓9,10の欠点を持っています。さらに、特別な住宅、機器、およびスタッフは、高コストで接続されているし、常に、教育機関で利用されていないすべての大型動物モデルが必要です。実験動物は、ラットやマウスに含まれます。ラットと比較して、マウスは、低コストの利点とさまざまなモデルをノックアウトの存在があります。このビデオで説明されているモデルは、アポ-/-マウス西部飼料動脈硬化血管12血管形成術の臨床設定を忠実に再現すると併用できます。以前のモデルは、ワイヤー傷害13、流体乾燥14、春15、またはカフ傷害16を介して血管損傷を誘発しました。開発と MH の憲法にけがの性質に大きく影響するので臨床場面を模倣する最良の方法は、バルーン カテーテルを使用して血管損傷を誘発します。
この記事ではマウスのバルーンカテーテルと MH を誘導する手法について述べる.RX ポート (図 1 a) バルーンカテーテル (1.2 mm × 6 mm) の使用する内膜層のと同時に、船の overdistension の誘導にこする。これらの要因の両方が MH の開発のための重要なトリガーです。このモデルの観測時間は 28 日17歳です。
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Protocol
動物実験動物の原則のためのガイドに準拠した人道的なケアを受けて、実験動物資源の研究所でを準備、健康の国民の協会によって公開されました。動物のすべてのプロトコルは、(「Amt こだわり健康を祝して und Verbraucherschutz、ハンザ (健康および消費者保護のためのオフィス)」) 責任がある地方自治体によって承認されました。
1. カテーテルの準備
注: はカテーテルについては材料の表を参照してください。
- カテーテルをカテーテル ホルダーから取る。
- うち遠位ポートを通して内腔からガイドワイヤーを引き上げます。
- カテーテルの遠位端にシアノアクリ レート系接着剤のドロップを置きます。
注意: は、ラテックスやニトリル手袋を着用します。 - カテーテルの RX ポートにガイドワイヤを置き、遠位のポートに内腔進みます。その後、ガイドワイヤ少し引き終わりに 〜 5 mm のスペースを残して。
- 乾燥して接着剤を許可する 5 分を待ちます。
- ガイドワイヤを移動、それは修正される必要があります。まだ携帯電話の場合は、手順 1.3-1.6 を繰り返します。
- 1.5 mL 0.9% 生理食塩水 3 mL シリンジを入力し、バルーン膨張ポートに接続します。
- バルーンの膨張をテストするシリンジのプランジャーを押してください。0.6 mL のシリンジに生理食塩水を残します。
2. マウス作製
- 重さ約 30 g 14 週齢で雄マウスを取得します。
注意: 動物実験動物研究所からの取得を使用しています。我々 はここで c57bl/6 j を使用しました。 - Anaesthetize 2.0 2.5 %isofurane (500 mL/分の酸素流量) とマウスに誘導室を使用します。
- 加熱パッドの上にマウスを置くし、マウスの鼻と口を覆うマスクで麻酔を維持します。後部のフィートと反射の不在を確認する尻尾をつまんで麻酔の十分な深さを確認します。
- 髪トリマーを使用して腹部の毛を削除します。
- 後肢の足を広げ、テープを使用して自分の位置を修正します。
- 続いて 80% エタノール、ポビドン ヨードを使用して腹部領域を消毒します。この手順をさらに 2 回繰り返します。
- 手術部位は汚染を取得されないように手術用ドレープを使用します。に沿って皮膚や筋肉層を開く、リネア アルバシザー (またはメス) 腹部の臓器を公開します。
- 0.9% 生理食塩水うるおい手袋で腸を置くし、湿潤を保つためにラップします。
- 腹部大動脈上脂肪組織を除去するのに 2 つの微細鉗子を使用します。
- インスリン注射器 (30 G) を使用して、下大静脈 (IVC) にヘパリン溶液 (50 U/mL) の 250 μ L を注入し、全身の分布の 3 分を待ちます。ヘパリンが止血を抑制し、手術中に不要な凝固を防ぐ。
- 2 つの鉗子を使用すると、その分岐とその発信の分岐血管まで高齢者大動脈を解剖します。
- 高温師と固定の領域に配置すると予想される側血管を縛る。
- 腎動脈のすぐ下に上行大動脈のクランプによって血流を停止します。
- 遠位大動脈分岐のすぐ上に 2 番目のクランプを配置します。
- 小さな水平切開血管に沿ってクランプの間の中間点にはさみを使用してを実行します。
注: 切開の大きさは船のまわりの 3 分の 1 に相当する必要があります。 - 切開 (30 G) 針と注射器を挿入し、250 μ L ヘパリン溶液 (50 U/mL) と大動脈をフラッシュします。
- 10-0 縫合糸を使用して、切開の各側に 1 つの単一の結び目を配置します。
- 大動脈を切開に容器ガイドワイヤーを挿入して広げるし、容器を少し広げます。2 ~ 3 回拡張を繰り返します。
- 0.9% 生理食塩水をカテーテルに潤いを与えます。
- 大動脈に平面的なバルーンカテーテルを挿入し、大動脈に近位のクランプの方それを進めます。
- 近位部のクランプに達し、慎重に近位のクランプを開き、~0.6 mL の生理食塩水を注入することで血液の漏出を防ぐためにバルーンを膨らませます。
注: 血管にバルーンを膨らませての比は 1.5: 1 です。 - 約 2 cm の逆行性のカテーテルを進めます。
- 注射器を外して少しバルーンをしぼませるながら戻って、拡張カテーテルを引き出します。
- カテーテル大動脈切開に達するとは、近位部のクランプを接続し直します。完全にバルーンを収縮し、それを削除します。
- 30 G の注射器を使用して 250 μ L ヘパリン溶液 (50 U/mL) と大動脈をすすいでください。
- 10-0 縫合糸を用いた大動脈切開を閉じる。場所は、腹側に 1 つか 2 つのステッチに続いて、各側面にステッチを中断しました。
- 遠位クランプを開きます。出血の場合、クランプを閉じて、追加ステッチを配置します。
- 慎重に近位のクランプを開きます。
- それをサポートし、任意の出血を止める縫合に 2 つ綿棒を配置します。
- それを維持するために縫合を吸収性止血剤を配置します。
注: 大動脈脈が切開部から遠位表示されます。 - 腹部に腸を配置します。
- あらかじめ 37 ° C に加温されている滅菌生理食塩水 0.9%、腹腔内を洗浄します。
- 6-0 実行縫合糸を使用して腹部の筋肉層を閉じます。
- 5-0 実行縫合糸で皮膚を閉じます。
- 目を覚ますには、マウスを許可する前にカルプロフェンの 4-5 mg/kg を皮下注入します。それは意識を得ていますまで、動物を監視、胸骨の横臥を維持します。完全な復旧までケージの中だけで動物をしてください。
- 3 日間の鎮痛薬として飲用水 (50 mg/100 mL) に Metamizole を追加し、毎日動物を監視します。通常甘いようなマウスは metamizole の味し、手術後すぐに飲み始めます。優先、徐放性注射剤は metamizole の代わりに使用できます。
注: このモデルの観察期間は 28 日です。
3. 病理組織学的
- 2.2 に 2.9 の手順で説明するように、マウスを準備することによって、28 日後バルーン損傷大動脈を収穫します。
- はさみを使用してバルーン損傷大動脈 (間分岐と腎血管上 0.3 mm) を削除し、その心を切り出してマウスを安楽死させます。
- 0.9% と血管の内腔を洗い流す塩化ナトリウム。
- 一晩 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で収穫された容器を修正し、5 時間の 2 時間、2 時間、1 時間の 80% エタノール、95% エタノール 70% エタノールで始まるエタノールそして 100% のエタノール濃度の増加で脱水します。その後、孵化させなさいキシレンのサンプル 2 時間 3 回、サンプルはパラフィンを浸透させる前に。
注: 0.9% の収穫の容器をフラッシング代わりに、塩化ナトリウム 4% とフラッシュすることが PFA。
注意: PFA とキシレン有毒である、特別な注意して処理する必要があります。 - パラフィン サンプルを埋め込み、ミクロトームを用いた 5 μ m 厚のスライスに切る。
- 5 分間 3 回キシレンとスライドを deparaffinize します。
- エタノールの減少シリーズを使用して組織スライドを水分補給します。100% のエタノール 2 回の 95%、80%、70% のエタノールの 3 分後、5 分で開始します。
- 説明18としてマッソンのヒアリン染色でスライドを染色します。
- 2 回 10 分ずつの 100% エタノールで汚されたスライドを脱水します。2 回 10 分ずつのキシレンでクリアし、メディアをマウントでマウントします。
- 明視野顕微鏡でスライドを表示します。概要図や詳細な観察のための 0.35 の開口と 20 x 倍率とレンズの 5 倍の倍率と 0.12 の開口レンズを使用します。
4. 蛍光顕微鏡
- エタノールの減少シリーズを使用して組織スライドを水分補給します。100% のエタノール 2 回の 95%、80%、70% のエタノールの 3 分後、5 分で開始します。
- 20 分間蒸し器で抗原検索ソリューション内のスライドを加熱することによって抗原検索を実行します。
- 室温までスライドを冷ます。
- スライドをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 3 回洗浄した後に、30 分のセクションにブロッキング液の抗原を適用します。
- 3 回 PBS で 5 分用のスライドを洗います。
- 一次抗体の希釈剤で希釈した一次抗体とのセクションを孵化させなさい。
注: 右の濃度と潜伏期間は、各抗体で別々 に選択する必要があります。 - 3 回自由な抗体を削除する PBS で 5 分用のスライドを洗います。
- 二次抗体の希釈剤で希釈済み共役二次抗体とセクションを孵化させなさい。
注: 右の濃度と潜伏期間は、各抗体で別々 に選択する必要があります。 - 5 分用のスライドを 3 回洗浄することにより非連結抗体を削除します。
- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15 分; を使用して細胞核を counterstain します。最終的な DAPI 濃度が 350 をする必要があります nM。
- 蛍光抗体法対応ソリューションを装着でのスライドをマウントします。
注: は間違って実装ソリューションを使用して蛍光信号が見えなくなります。 - 蛍光顕微鏡でスライドを表示します。1.3 の開口で 40 倍の倍率を使用します。
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Representative Results
バルーン侵食は、マウスで MH の開発研究に適したモデルです。動物手術から回復を示し、優れた物理的な条件術後。このモデルは、50 マウス外科的処置のための 3% の死亡率よりも少ないに設立しました。図 1 b-Cは、主な手術手順を表示します。に沿って皮膚切開後、 linea alba、腹部大動脈を識別します。顕微鏡視下クランプ (図 1 b) を配置します。大動脈の真ん中に小さな切開を行う、容器とスライド (図 1) の血流の方向に対して、それが逆行性にバルーンカテーテルを設定します。膨らんだバルーンの動きは、内膜のと同時に、容器の overdistension を削りにつながります。大動脈切開は、単一 stiches に閉鎖されます。大動脈脈は、切開部から遠位に見えるはずです。
MH は、時間をかけて徐々 に移植開発します。組織染色とマッソンのヒアリン示します myointima 陣中内弾性板 (図 2 a)。Myointimal 病変から成っていた主に肯定的な細胞成分 SM22 といくつかの細胞外マトリックス成分 (図 2 b)。Myointimal 細胞は, 免疫蛍光染色でさらに評価されます。Myointima の主要な人口は、平滑筋 (平滑筋アクチン (SMA) 肯定的な) 細胞および芽細胞 (線維芽細胞活性化タンパク質 (FAP) 肯定的な) (図 2 b) で構成されます。
図 1。カテーテル、その注入の模式図。(A)カテーテルの詳細な概略図です。遠位ポート、バルーン、急速な交換ポート (受信ポート)、ガイドワイヤー、RX ポート、単一内腔 RX ポートからハブ バルーン、バルーン膨張ポートのルーメンをダブルクリックします。(B)手術の模式図。2 つのマイクロ クランプで腹大動脈の血流が停止し、小切開を行います。C.腹部大動脈内膨張のカテーテル。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。内弾性板内 Myointima の形成。(A) Denuded マウス大動脈を収穫、パラフィンに埋め込まれたとヒアリン染色に代表断面を示します。(B)二重蛍光染色バルーン裸気嚢が表示されます。上の行は、SM22 とコラーゲン III 染色 myointimal 病変を示しています。最下行の船は SMA と FAP のステンド グラスします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この記事は、myointimal 過形成の開発を研究するマウスモデルを示し、根本的な病理学的プロセスの探査と新しい薬や治療法のテストをことができます。
このプロトコルでは最も重要なステップは、大動脈の剥離です。特別な注意は、過剰な侵食が動脈瘤の形成とモデルが失敗につながる、このステップの間にお支払いください。その一方で、侵食が十分に実行された場合、少なすぎる myointima を開発します。したがって、侵食ステップの強度は、結果とこの動物モデルの成功にとって重要です。
外科手術に関して、縫い目がはがれて血管の開存性の初期故障につながる可能性がありますを設定することにより容器の 2 つの壁にピアスされていない重要です。マウス18腹部大動脈の血管狭窄、誘導されるマウス モデルは前述しました。ただし、これと他のほとんどのモデル、分析、組織の非常に少量がのみ。この方法の利点は、(~ 1 cm 容器セグメント) を得られる組織の比較的大きなされています。単一の容器の移植を複数の部分に分かれて従ってし様々 な分析、効果的に必要な実験動物の数を減らすために使用できます。
さらに、適切なノックアウト動物は異なった病気の条件で myointima の過形成の研究開発に使用できます。遺伝的背景は、さまざまな設定または特定の遺伝子の影響で myointimal 増殖のメカニズムを理解するこの動物モデルと組み合わせることもできます。
要約すると、ここで説明するモデルは再生可能で、行うには、簡単、迅速かつ確実に確立することができます。このモデルでオプションがさらに大きな動物で確認できます正常にテストの治療は、19をモデル化します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者はクリスティアーネ ・ Pahrmann の彼女の技術的な援助をありがちましょう。
社殿は、最大 Kade 財団によって支えられました。両手を使った受信助成他 Kröner 財団 (2012_EKES.04) とドイツ研究振興協会 (DE2133/2-1 _。S. s. は、ドイツ研究振興協会 (DFG; から研究助成を受けてください。SCHR992/3-1、SCHR992/4-1)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10-0 Ethilon suture | Ethicon | 2814G | |
3 mL Syringe | BD Medical | 309658 | |
37% HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | |
5-0 prolene suture | Ethicon | EH7229H | |
6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
Acid Fuchsin | Sigma-Aldrich | F8129-25G | Trichrome staining |
Antigen retrieval solution | Dako | S1699 | |
Azophloxin | Waldeck | 1B-103 | Trichrome staining |
Bepanthen Eye and Nose ointment | Bayer | 1578675 | Eye ointment |
Betadine Solution | Betadine Purdue Pharma | NDC:67618-152 | |
C57BL/6J | Charles River | Stock number 000664 | |
Clamp applicator | Fine Science Tools | 18056-14 | JAW DIMS: 4 x 0.75 mm LENGTH: 13 mm |
Collagen 3 | abcam | ab7778 | Antibody |
DAPI | Thermo Fischer | D1306 | |
Donkey anti-Goat IgG AF555 | Invitrogen | A21432 | Secondary antibody |
Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A21206 | Secondary antibody |
Donkey anti-Rabbit IgG AF488 | Invitrogen | A11055 | Secondary antibody |
Donkey anti-Rabbit IgG AF555 | Invitrogen | A31572 | Secondary antibody |
Ethanol 70% | Th. Geyer | 2270 | |
Ethanol 96% | Th. Geyer | 2295 | |
Ethanol absolute | Th. Geyer | 2246 | |
FAP | abcam | ab28246 | Antibody |
Forceps fine | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Forceps standard | Fine Science Tools | 11023-10 | |
Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
Hair clipper | WAHL | 8786-451A ARCO SE | |
Heparin | Rotexmedica | PZN 3862340 | 25.000 I.E./mL |
High temperature cautery kit | Bovie | 18010-00 | |
Image-iT FX Signal Enhancer | Invitrogen | I36933 | Blocking solution |
Light Green SF | Waldeck | 1B-211 | Trichrome staining |
Microsurgical clamp | Fine Science Tools | 18055-04 | Micro-Serrefine - 4mm |
MINI TREK Coronary Dilatation Catheter 1.20 mm x 6 mm / Rapid-Exchange | Abbott | 1012268-06U | |
Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 1.00532.0100 | Trichrome staining |
NaCl 0,9% | B.Braun | PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160 | |
Needle holder | Fine Science Tools | 12075-14 | |
Novaminsulfon | Ratiopharm | PZN 03530402 | Metamizole |
Orange G | Waldeck | 1B-221 | Trichrome staining |
Paraffin | Leica biosystems | REF 39602004 | |
PBS pH 7,4 | Gibco | 10010023 | |
PFA 4% | Electron Microscopy Sciences | #157135S | |
Ponceau S solution | Serva Electrophoresis | 33427 | Trichrome staining |
Primary antibody diluent | Dako | S3022 | |
Prolong Gold Mounting solution | Thermo Fischer | P36930 | Mounting solution for immunofluorescence stained slides |
Replaceable Fine Tip | Bovie | H101 | |
Resorcin-Fuchsin Weigert | Waldeck | 2E-30 | Trichrome staining |
Rimadyl | Pfizer | 400684.00.00 | Carprofen |
Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Scissors Vannas-style | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Secondary antibody diluent | Dako | S0809 | |
Fast acting Adhesive MINIS 3x1g | UHU | 45370 | Cyanoacrylate |
Slide Rack | Ted Pella | 21057 | |
SM22 | abcam | ab10135 | Antibody |
SMA | abcam | ab21027 | Antibody |
Staining dish | Ted Pella | 21075 | |
Surgical microscope | Leica | M651 | |
Tabotamp fibrillar | Ethicon | 431962 | Absorbable hemostat |
Transpore Surgical Tape | 3M | 1527-1 | |
U-100 Insulin syringe | BD Medical | 324825 | |
Vessel Dilator | Fine Science Tools | 18603-14 | |
Vitro-Clud | Langenbrinck | 04-0001 | |
Weigerts iron hematoxylin Kit | Merck | 1.15973.0002 | Trichrome staining |
Xylene | Th. Geyer | 3410 |
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