Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD
Summary
Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) – une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.
Abstract
Le développement du cerveau est un processus complexe, qui est contrôlé de manière temporo-spatiale par des gradients de morphogènes et différents programmes transcriptionnelles. En outre, des modifications épigénétiques chromatine, comme la méthylation des histones, ont un rôle important pour établir et maintenir des destins de cellule spécifique au sein de ce processus. La grande majorité de la méthylation des histones se produit sur la queue de l’histone flexible, qui est accessible aux modificateurs d’histone, gommes à effacer et histones lecteur. En revanche, la méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3 et est impliquée dans les différentes fonctions du développement. Méthylation de l’H3K79 est conservée évolutives et se trouvent dans un large éventail d’espèces de l’Homo sapiens à Saccharomyces cerevisiae. La modification se produit dans différentes populations cellulaires au sein d’organismes, y compris les progéniteurs neuraux. L’emplacement de la méthylation de H3K79 dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est difficile à évaluer. Ici, nous présentons des méthodes pour isoler et progénitrices corticale de la culture des cellules (CPC) de tissus embryonnaires cerveau cortical (E11.5-E14.5) ou les progéniteurs des neurones granulaires cérébelleux (CGNPs) de tissus de postnatal (P5-P7) et efficacement immunoprécipitation H3K79me2 pour la PCR quantitative (qPCR) et le séquençage de génome.
Introduction
Les fonctions sensorielles, motrices et cognitives du cerveau sont très complexes et sensibles aux changements physiques et environnementaux. Le cerveau est constitué de trois parties générales le hind-, moyennes et du cerveau, qui sont profondément liées. Dans le cerveau antérieur, le télencéphale se divisent en une dorsale télencéphale (DT) et un télencéphale ventral (VT). La DT de souris se compose de six couches corticales qui sont forment entre E11.5 et E18.5 dans une façon de « inside-out »1. Le VT comprend les éminences ganglionnaires dans le développement, qui forment plus tard les ganglions de la base2,3. Plusieurs types de cellules peuvent être classés dans le système nerveux central chez les mammifères tels que les neurones, astrocytes, oligodendrocytes4ou qui se développent dans une manière temporo-spatiale5. Tout d’abord, les cellules progénitrices neurales (PNJ) donnent lieu à différents types de neurones, les interneurones dans le VT et des neurones de projection dans la DT et plus tard sur les cellules gliales (p. ex., les astrocytes,6). Au cours du développement cortical, couche la plus superficielle (couche I), qui contient des cellules de Cajal-Retzius, est formé en premier. Puis, entre E12.5 et E14.5, PNJs génèrent des plus profondes couches neuronales (VI, V) tandis qu’entre 14,5 et 16.5, progéniteurs donnent lieu à des neurones de la couche supérieure (IV-II)7,8. Aucune identité neuronale est spécifié par différents programmes temporo-spatiale transcriptionnelles induite sur les capacités et en outre par l’épigénétique programmes2.
Le cervelet, qui est impliqué dans la coordination motrice, est situé dans le cerveau postérieur et se développe entre E10 et environ P20 souris9. Il contient le cortex cérébelleux et les noyaux cérébelleux10. Le cortex cérébelleux adult se compose de trois couches, la couche moléculaire, la couche de cellules de Purkinje et la couche granulaire interne contenant des neurones granulaires10. Les microglies cérébelleuses sont les plus petits neurones et représentent environ 80 % de tous les neurones dans le cerveau de vertébrés11. Ils se développent à partir des précurseurs situés dans la zone externe de germinale et migrent à travers la couche de cellules de Purkinje à leur destination12. Comme dans le télencéphale, le développement du cervelet est régi par plusieurs morphogènes importants, qui ont des fonctions spécifique et espace-dépendant du temps et initier défini transcriptionnelle programmes10.
Le développement des couches corticales et cérébelleux est contrôlé par l’expression transcriptionnelle de morphogènes spécifiques et, ainsi, par l’état de la chromatine de l’ADN. Dans une vue simplifiée, les États de la chromatine se divisent en euchromatine comme activité de transcription et hétérochromatine comme régions transcriptionally silencieuses. Le nucléosome est l’unité fondamentale de la chromatine contient deux copies de chaque histone core H2A, H2B, H3 et H4, entouré de 147 paires de bases d’ADN13. Les histones sont hautement post-traductionnellement modifiées par méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitination, sumoylation, ADP-ribosylation, désamination et proline isomérisation14,15. Méthylation de lysine histone est réputée être la modification d’histone plus stable qui contrôle la transcription, réplication, recombinaison16, dommages à l’ADN réponse17et l’empreinte génomique18. Lysines peuvent être mono-, di- ou tri-méthylés19 et apparaissent non seulement sur les queues d’histone accessible, mais aussi au sein du domaine globulaire d’histones20. Les méthylations spécifiques à H3K4 et H3K36 sont principalement liées à l’euchromatine, méthylations spécifiques au H3K9, H3K27 ou H4K20 se trouvent principalement dans des régions hétérochromatiques, bien que tous les résidus sont situés au sein de l’histone Queue14, 19,,21. Méthylation de l’H3K79 est située dans le domaine globulaire histone et a été associée à l’activité transcriptionnelle, mais aussi avec les régions génomiques transcriptionnellement inerte22. La modification est conservée évolutif puisqu’il a été observé chez la levure, thymus de veau, poulet et humaine23. H3K79 mono, di et triméthylation (H3K79me1, me2, me3) sont catalysées par l’histone methyltransferases DOT1L24,25 et le nucléaire SET contenant du domaine Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L est impliqué dans la prolifération et réparation de l’ADN cellulaire reprogrammation27. Perte de Dot1l chez la souris entraîne un décès prénatal autour du stade de développement de28,E10.529. Au cours du développement du cœur et dans la différenciation myocardiocyte, DOT1L est essentiel pour gene expression règlement30. Dans le système nerveux central, DOT1L fonction pourrait être impliquée dans le tube neural development31, il est impliqué dans la répression des Tbr1-expression lors du prosencéphale développement32et peuvent fonctionner dans la régulation du stress du re gènes de réponse33. L’activation dépendante du contexte ou la répression action de H3K79me, en particulier avec in vivo des situations comme le développement du système nerveux central, est à ce jour, seulement partiellement compris32. Méthylation de l’H3K79 se trouve dans le domaine globulaire de l’histone 3, il est stériquement moins accessible par rapport à des modifications sur l’histone flexible queues23. Pour comprendre la fonction de méthylation de l’H3K79, des méthodes d’analyse fiables et reproductibles pour déterminer son emplacement et son environnement génomique sont nécessaires. Dans cet article des méthodes, nous présentons des méthodes d’isolation des différentes progéniteurs neurones (CPC pour le cortex) et CGNPs pour le cervelet, un traitement inhibiteur de la DOT1L efficace et une méthode de puce pour analyser H3K79 méthylation par qPCR ou séquençage en temps différents points au cours du développement cortical et cérébelleux. Pour une vue d’ensemble du protocole et de ses possibilités, voir la Figure 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a deux façons principales pour effectuer l’immunoprécipitation de la chromatine pour détecter l’occupation génomique des modifications d’histone, facteurs de transcription, lecteurs de code histone, écrivains ou gommes à effacer. On est la méthode native de la puce à l’aide de nucléase digérée, chromatine native pour l’immunoprécipitation, et l’autre est la méthode présentée à l’aide de la chromatine PFA-fixes et cisaillée, dans lequel les nucléosomes et autres protéines ADN-attaché…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Henriette Bertemes pour aider à l’établissement du protocole de culture CGN au sein du laboratoire. Ce livre de la méthode était soutenu par l’épigénétique financés par le DFG CRC992 médicale en finançant à la télévision. Les auteurs tiennent à souligner le soutien de l’équipe de galaxie de Freiburg : Pavankumar Videm, Björn Grüning et Prof. Rolf Backofen, bioinformatique, Université de Freiburg, en Allemagne, financé par Collaborative Research Centre 992 médical épigénétique (subvention DFG SFB/992/1 2012) et ministère fédéral allemand de l’éducation et la recherche (BMBF subvention 031 A538A RBC (de. NBI)).
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
References
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