Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca
Summary
Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) – una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.
Abstract
Desarrollo del cerebro es un proceso complejo, que es controlado en forma temporo-espacial por gradientes de morfógenos y diferentes programas transcripcionales. Además, modificaciones epigenéticas de la cromatina, como la metilación de las histonas, tienen un papel importante para establecer y mantener destinos celulares específicas dentro de este proceso. La gran mayoría de la metilación de las histonas se produce en la cola de la histona flexible, que es accesible a los modificadores de las histonas, los borradores y proteínas de histona lector. En cambio, metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3 y está implicada en diversas funciones del desarrollo. H3K79 metilación evolutionarily se conserva y puede encontrarse en una amplia gama de especies de Homo sapiens a Saccharomyces cerevisiae. La modificación se produce en diferentes poblaciones celulares dentro de los organismos, incluyendo progenitores neuronales. La ubicación de la metilación de H3K79 en el dominio globular de la histona 3 hace difícil evaluar. Aquí se presentan métodos para aislar y progenitor cortical cultura (CPCs) con células de tejido embrionario cerebro cortical (E11.5-E14.5) o progenitores de neuronas granulares cerebelosas (CGNPs) del tejido postnatal (P5-P7) y eficientemente immunoprecipitate H3K79me2 para PCR cuantitativa (qPCR) y secuenciación del genoma.
Introduction
Las funciones sensoriales, motores y cognitivas del cerebro son altamente complejas y susceptibles a los cambios físicos y ambientales. El cerebro consta de tres partes generales el hind-, mediados de y prosencéfalo, que están profundamente conectados. En el prosencéfalo, el telencéfalo puede dividirse en un telencéfalo dorsal (DT) y un telencéfalo ventral (VT). El DT de los ratones consiste en seis capas corticales que se forman entre E11.5 y E18.5 en una manera de “inside-out”1. El VT incluye las eminencias ganglionares en desarrollo, que posteriormente forman los ganglios basales2,3. Varios tipos celulares se pueden clasificar en mamífero sistema nervioso central tales como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos4, que se convierten en una forma temporo-espacial5. En primer lugar, las células progenitoras neurales (PNJ) dan lugar a diferentes tipos de neuronas, interneuronas en las VT y las neuronas de proyección en el despegue y más tarde en las células gliales (p. ej., astrocitos6). Durante el desarrollo cortical, la capa más superficial (capa I), que contiene las células de Cajal-Retzius, está formado en primer lugar. Luego, entre E12.5 y E14.5, NPCs generan capas más profundas neuronales (VI, V) mientras que entre 14,5 y 16,5, progenitores dan lugar a las neuronas de la capa superior (IV-II)7,8. Identidad neuronal está especificado por diferentes programas transcripcionales temporo-espacial inducida por morfógeno y además por programas epigenéticos2.
El cerebelo, que está implicado en la coordinación motora, se encuentra en el cerebelo y se desarrolla entre E10 y P20 en ratones9. Contiene la corteza cerebelosa y los núcleos cerebelosos10. La corteza cerebelosa adultos consta de tres capas, la capa molecular externa, la capa de células de Purkinje y la capa granular más interna que contiene las neuronas granulares10. Las células del gránulo cerebeloso son las neuronas más pequeñas y representan alrededor del 80% de todas las neuronas en el cerebro vertebrados11. Se desarrollan a partir de precursores en la zona germinal externa y migran a través de la capa de células de Purkinje a su destino12. Como en el telencéfalo, el desarrollo del cerebelo está regulado por varios importantes morfógenos, que tienen funciones específicas de tiempo y espacio dependiente e iniciar define programas transcripcionales10.
El desarrollo de capas corticales y cerebelosas es controlado por la expresión transcripcional de morfógenos específicos y, por tanto, el estado de la cromatina de la DNA. En una visión simplificada, Estados de la cromatina pueden dividirse en eucromatina como transcripcionalmente activo y heterocromatina regiones transcripcionalmente silencioso. Como la unidad básica de la cromatina nucleosoma contiene dos copias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 y H4, rodeado de 147 pares de bases de ADN13. Las histonas son modificadas altamente postraduccional por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, la sumoilación, ADP-ribosylation, desaminación y prolina isomerización14,15. La metilación de lisina de las histonas se considera que la modificación de las histonas más estable que controla la transcripción, replicación, recombinación16, daño de la DNA respuesta17e impresión genómica18. Lisinas pueden ser mono-, di- o tri-metilados19 y aparecer en las colas de las histonas accesible, sino también en el dominio globular de las histonas20. Metilaciones específicas en H3K4 y H3K36 se asocian principalmente a eucromatina, metilaciones específicas en H3K9 H3K27 y H4K20 se encuentran principalmente en regiones heterochromatic, aunque todos los residuos se encuentran a la cola de las histonas14, 19,21. Metilación de H3K79 se encuentra en el dominio globular de las histonas y se ha asociado con la actividad transcripcional, sino también con las regiones genomic transcripcionalmente inerte22. La modificación evolutionarily se conserva ya que se ha observado en levaduras, timo de ternero, pollo y humana23. H3K79 mono, di y trimetilación (H3K79me1, me2 y me3) son catalizadas por la histona metiltransferasas DOT1L24,25 y la Nuclear conjunto dominio-que contienen la proteína 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicado en la proliferación y reparación del ADN celular reprogramación27. Pérdida de Dot1l en ratones conduce a una muerte prenatal alrededor de la etapa de desarrollo E10.528,29. Durante el desarrollo del corazón y en la diferenciación de myocardiocyte, DOT1L es esencial para gene expresión Reglamento30. En el sistema nervioso central, función DOT1L podría estar implicada en el tubo neural desarrollo31, está implicado en la supresión de Tbr1-expresión durante el desarrollo de cerebro anterior32y puede funcionar en la regulación de la tensión ER de genes de respuesta33. Contexto-dependiente de la activación o represión acción de H3K79me, especialmente con en vivo situaciones como el desarrollo del sistema nervioso central, es hasta la fecha sólo parcialmente entendida32. Puesto que la metilación del H3K79 se encuentra en el dominio globular de la histona 3, es sterically menos accesible en comparación con modificaciones de la histona flexible cola23. Para entender la función de la metilación de H3K79, se necesitan métodos de análisis fiables y reproducibles para determinar su ubicación y entorno genómico. En este trabajo métodos, presentamos métodos de aislamiento de diferentes progenitores neuronales (CPCs de la corteza) y CGNPs para el cerebelo, eficaz tratamiento del inhibidor de DOT1L y un método de ChIP para analizar H3K79 metilación mediante qPCR o secuenciación en tiempo diferente puntos durante el desarrollo cortical y cerebeloso. Para tener una visión general del protocolo y sus posibilidades, vea la figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay dos maneras principales de inmunoprecipitación de cromatina para detectar la ocupación genómica de modificaciones de las histonas, factores de transcripción, lectores de código de las histonas, escritores o gomas de borrar. Uno es el método de ChIP nativo con nucleasa digerida, la cromatina nativa para la inmunoprecipitación, y el otro es el método presentado con cromatina PFA-fijo, esquilada, en el que los nucleosomas y otras proteínas ADN Unido están covalentemente al ADN 39. ChIP …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Henriette Bertemes para ayudar a establecer el protocolo de cultivo de CGN dentro del laboratorio. Este papel de método fue apoyada por la DFG financió CRC992 médico epigenética por financiación a TV. Los autores reconocen el apoyo del equipo galaxia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning y Prof. Rolf Backofen, bioinformática, Universidad de Freiburg, Alemania financiado por colaboración investigación 992 centro médico epigenética (grant DFG SFB 992/1 de 2012) Ministerio Federal alemán de educación e investigación (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
References
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