Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3
Summary
Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) – uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.
Abstract
Desenvolvimento do cérebro é um processo complexo, que é controlado de forma temporo-espacial por gradientes de diferentes programas transcriptional e morphogens. Além disso, modificações epigenéticas cromatina, como metilação de histonas, têm um papel importante para o estabelecimento e manutenção de destinos de célula específica dentro deste processo. A grande maioria de metilação de histonas ocorre na cauda do histone flexível, que é acessível para modificadores de histona, borrachas e histona leitor de proteínas. Em contraste, a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3 e está implicada nas diferentes funções do desenvolvimento. H3K79 metilação é evolutivamente conservada e pode ser encontrada em uma ampla gama de espécies de Homo sapiens de Saccharomyces cerevisiae. A modificação ocorre em populações de células diferentes dentro de organismos, incluindo os progenitores neurais. A localização da metilação de H3K79 no domínio globular de histona 3 torna difícil de avaliar. Aqui, apresentamos métodos para isolar células e e progenitoras cortical de cultura (CPCs) de tecido embrionário cerebral cortical (E11.5-E14.5) ou progenitores cerebelar neurônio granular (CGNPs) do tecido pós-natal (P5-P7) e de forma eficiente immunoprecipitate H3K79me2 por PCR quantitativo (qPCR) e sequenciamento do genoma-largo.
Introduction
As funções cognitivas, motor e sensoriais do cérebro são altamente complexo e suscetível a mudanças físicas e ambientais. O cérebro é composto por três partes gerais o hind-, mid-e prosencéfalo, que estão profundamente ligados. Dentro do posencéfalo, o telencéfalo pode ser dividido em um telencéfalo dorsal (DT) e um telencéfalo ventral (VT). O DT de ratos consiste de seis camadas corticais que são formadas entre E11.5 e E18.5 em uma maneira de “dentro para fora”1. O VT inclui as Eminências ganglionar em desenvolvimento, que mais tarde formam o gânglio basal2,3. Vários tipos de células podem ser classificados no sistema nervoso central dos mamíferos como neurônios, astrócitos ou oligodendrócitos4, que se desenvolvem em uma maneira temporo-espacial5. Primeiro, as células progenitoras neurais (NPCs) dão origem a diferentes tipos de neurônios, interneurônios no VT e os neurônios de projeção no DT e mais tarde sobre células gliais (por exemplo, astrócitos6). Durante o desenvolvimento cortical, a camada mais superficial (camada mim), que contém células de Cajal-Retzius, é formado em primeiro lugar. Então, entre E12.5 e E14.5, NPCs geram camadas mais profundas neuronais (VI, V) enquanto entre 14,5 e 16.5, progenitores dão origem a camada superior (IV-II) neurônios7,8. Identidade neuronal é especificada por programas de transcriptional temporo-espacial induzida por morphogen diferentes e, adicionalmente, por programas epigenéticas2.
O cerebelo, que está implicado na coordenação motora, situa-se no rombencéfalo e se desenvolve entre E10 e aproximadamente P20 em ratos9. Ele contém o córtex cerebelar e os núcleos Cerebelares10. O córtex cerebelar adulto consiste de três camadas, a camada mais externa de molecular, a camada de células de Purkinje e a camada mais interna granular contendo neurônios granulares10. As células grânulo cerebelar são os menores neurônios e representam cerca de 80% de todos os neurônios do cérebro de vertebrados11. Eles desenvolvem a partir de precursores, localizados na zona germinal externa e migram através da camada de células de Purkinje para seu destino12. Como no telencéfalo, o desenvolvimento do cerebelo é regulamentado por vários morphogens importantes, que têm funções específica e espaço-dependente do tempo e iniciar definido programas transcriptional10.
O desenvolvimento das camadas corticais e Cerebelares é controlado pela expressão transcricional de morphogens específicas e, assim, pelo estado da cromatina do DNA. Em uma visão simplificada, cromatina Estados podem ser divididos em eucromatina como transcricionalmente ativo e heterocromatina como regiões transcriptionally silenciosas. Nucleossoma como unidade básica da cromatina contém duas cópias de cada histona núcleo H2A, H2B, H3 e H4, rodeado por 147 pares de bases do ADN13. Histonas são altamente post-translationally modificadas por metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitination, sumoylation, ADP-do ribosylation do, desaminação e prolina isomerização14,15. Metilação de histonas lisina é considerada a modificação do histone mais estável que controla a transcrição, replicação, recombinação16, danos no DNA resposta17e imprinting genômico18. Lisinas podem ser mono-, di- ou tri-misturado19 e aparecem não só sobre as caudas de histona acessível, mas também dentro do domínio globular de histonas20. Methylations específicos em H3K4 e H3K36 são principalmente associados com eucromatina, methylations específicas em H3K9, H3K27 ou H4K20 são encontradas principalmente em regiões heterocromático, apesar de todos os resíduos estão localizados dentro da cauda do histone14, 19,21. Metilação de H3K79 está localizada dentro do domínio globular de histona e tem sido associada com atividade transcricional, mas também com as regiões genômicas transcricionalmente inerte22. A modificação é evolutivamente conservada desde que foi observado no fermento, timo de vitela, frango e humano23. H3K79 mono, di e trimethylation (H3K79me1, me2, me3) são catalisadas por histona metiltransferases DOT1L24,25 e o Nuclear conjunto domínio-contendo proteínas 2 (Nsd2)26. DOT1L está implicada na proliferação e reparação do DNA celular reprograming27. Perda de Dot1l em ratos leva a uma morte pré-natal em torno de28,de E10.5 o estágio desenvolvente29. Durante o desenvolvimento do coração e na diferenciação de myocardiocyte, DOT1L é essencial para a expressão de gene Regulamento30. No sistema nervoso central, função DOT1L pode ser implicada no tubo neural desenvolvimento31, está envolvido em suprimir Tbr1-expressão durante o desenvolvimento de prosencéfalo32e podem funcionar na regulação do stress-ER genes de resposta33. O contexto-dependente ativando ou reprimir ação de H3K79me, especialmente com situações na vivo como o desenvolvimento do sistema nervoso central, é até à data apenas parcialmente compreendido32. Desde que a metilação de H3K79 situa-se no domínio globular de histona 3, é estericamente menos acessível em comparação com as modificações sobre a caudas de histona flexível23. Para entender a função do methylation H3K79, são necessários métodos de análise confiável e reprodutível para determinar sua localização e ambiente genômico. Neste trabalho de métodos, apresentamos os métodos de isolamento de diferentes progenitores neurais (CPCs para o córtex) e CGNPs para o cerebelo, tratamento eficaz de inibidor de DOT1L e um método de ChIP para analisar H3K79 metilação através do sequenciamento em horário diferente ou qPCR pontos durante o desenvolvimento cortical e cerebelar. Para uma visão geral do protocolo e suas possibilidades, veja a Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Há duas maneiras principais para realizar a imunoprecipitação da cromatina para detectar a ocupação genômica de modificações do histone, fatores de transcrição, leitores de código de histona, escritores ou borrachas. Um é o método de ChIP nativo usando nuclease digerida, cromatina nativa para a imunoprecipitação, e o outro é o método apresentado usando cromatina PFA-fixas, distorcida, em que os nucleosomes e outras proteínas DNA-inscritos são ligados covalentemente ao DNA 39. Ch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Henriette Bertemes ajudando a estabelecer o protocolo de cultivo CGN dentro do laboratório. Este papel método foi suportada pela DFG-financiado CRC992 médica epigenética financiamento para TV. Os autores reconhecem o apoio da equipe Galaxy Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof Rolf Backofen, bioinformática, Universidade de Freiburg, Alemanha, financiado pela colaboração pesquisa centro 992 médica epigenética (grant DFG SFB 2012 992/1) e o Ministério Federal alemão de educação e pesquisa (BMBF concessão 031 A538A RBC (de. NBI)).
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
References
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