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Recherche en cancérologie

肿瘤组织中高通量芯片测序的染色质状态全基因组图谱集成平台

Published: April 05, 2018
doi:
10.3791/56972
, , , , , , ,
1Department of Genomic Medicine,University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2The Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

在这里, 我们描述了一个优化的高通量芯片排序协议和计算分析管道, 以确定从冷冻肿瘤组织和细胞系的全基因组的染色质状态模式。

Abstract

组蛋白修饰是表观基因的主要组成部分, 在确定相关基因座的转录状态方面起着重要的调控作用。此外, 还使用特定的修改来确定位置和身份非编码功能元素, 如增强剂。近年来, 染色质免疫沉淀其次是下一代测序 (芯片序列) 已成为一个强有力的工具, 以确定基因组范围内的个别蛋白修饰的轮廓。然而, 越来越清楚的是, 染色质修饰的组合模式, 称为染色质状态, 决定了相关基因组轨迹的特征和性质。因此, 由健壮的高通量 (HT) 方法组成的工作流, 用于分析许多组蛋白修饰标记, 以及能够处理无数芯片序列分析数据集的计算分析管线, 因此需要大量样品中 epigenomic 状态的综合测定。这里提出的 HT 芯片序列工作流包括两个模块: 1) 一个实验性的协议, 用于分析从少量肿瘤样本和细胞系的96井格式的几个组蛋白修饰;和 2) 一个计算数据分析管道, 结合现有的工具, 以计算单独的标记占用和组合染色质状态模式。这两个模块结合在一起, 便于快速、高效地处理数以百计的芯片序列样本。本文介绍的工作流用于从黑色素瘤肿瘤和细胞系中的6组蛋白标记剖面中提取染色质状态模式。总的来说, 我们提出了一个全面的芯片序列的工作流程, 可用于许多人肿瘤标本和癌细胞株, 以确定 epigenomic 畸变在各种恶性肿瘤。

Introduction

大多数哺乳动物基因组 (98-99%) 由非编码序列组成, 这些 nocoding 区域包含已知参与控制基因表达和染色质组织 1, 2 的调控元素.在正常细胞中, 基因组 DNA 的特定组装进入致密的染色质结构, 对于各种 DNA 相关进程的空间组织、调控和精确定时至关重要, 这些过程3,4,5。然而, 在癌细胞中, 异常表观遗传机制的染色质修饰可能导致染色质结构的不正确组织, 包括获得调控元素、染色体循环系统和基因表达模式6, 7,8,9,10。

尽管最近取得了进展, 我们对与肿瘤进展或治疗反应相关的表观变化的理解有限。表观基因由一系列的修改组成, 包括组蛋白标记和 DNA 甲基化, 它们共同形成一个动态状态 (称为染色质状态), 它会影响基因表达网络和其他关键的过程来维持细胞身份。最近, 通过研究 H3K27Ac 配置文件11, 增强剂的改变已显示在多种恶性肿瘤中。虽然这些研究提供了对孤立的表观遗传标记的相关性的洞察力, 但100多种表观修改已被识别为12,13 , 而没有清楚地了解它们的生物学角色和相互 依赖。此外, 还有更多的可能组合模式的这些组蛋白和 DNA 的修改, 它是这些组合模式-而不是个别的修改-听写表观遗传学的状态14。因此, 在癌症进展或对治疗的反应中, 有必要确定这些染色质状态的变化.由于技术 (例如, 从少量临床材料/单细胞生成大规模数据) 和分析 (例如算法来定义, 癌症中表观基因改变的综合知识已经滞后于部分原因。组合状态) 的挑战。因此, 迫切需要强健的高通量方法来分析大量的组蛋白修饰标记, 从临床材料和易于实现的计算方法来预测组合模式, 这将有助于不同肿瘤分期和治疗耐药性相关的表观遗传状态的测定。此外, 从最近的表观基因分析研究中获得的数据15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22、23正常组织和细胞系可与肿瘤染色质剖面结合, 进一步深入了解表观基因对肿瘤生物学的贡献。

染色质分析已成为识别各种染色质修改的全局绑定模式的强大工具15,24。近年来, 芯片序列已成为研究全球尺度上的 DNA-蛋白质相互作用的 “金标准”25,26,27。对于任何芯片序列实验, 有必要的关键步骤, 它的成功, 包括组织处理和解除, 确定最佳超声波条件, 确定的最佳抗体浓度的降水, 图书馆准备,后测序数据处理和下游分析。这些步骤中的每一个都包含关键的质量控制检查点, 当两者结合在一起时, 对于正确识别功能验证的潜在目标至关重要。通过这些步骤的创新, 一些先前的研究已经开发出从少量组织执行芯片或芯片序列的方法28,29,30,31,32.此外, 一些研究还提出了高通量芯片实验的协议, 其次是基于 PCR 的定量33,34。最后, 一些公开可用的芯片序列数据分析平台现在可用, 如 Easeq35和 Galaxy36。然而, 在高吞吐量的方式下, 结合计算管道来执行单标记和染色质状态分析, 一个集成的平台来执行芯片序列。

本协议描述了一个完整和全面的芯片序列工作流程, 用于全基因组在肿瘤组织和细胞系中的染色质状态图谱, 并易于遵循指导原则, 包括成功实验所需的所有步骤。通过采用以前由 Blecher Gonen et描述的高通量方法。37, 此协议可在多个样本中并行执行, 并已成功应用于癌细胞系和人类肿瘤, 如黑色素瘤、结肠、前列腺和胶质瘤多形性。我们演示了六组核心组蛋白修饰的方法, 它代表了人类黑色素瘤细胞系和肿瘤样本中表观遗传调控景观的关键组成部分。这些修改包括 H3K27ac (增强剂)、H3K4me1 (积极和有活力的增强剂)、H3K4me3 (促进者)、H3K79me2 (转录区)、H3K27me3 (polycomb 镇压) 和 H3K9me3 (异色镇压)。这些标记可以单独或组合使用, 以确定代表压制性和活动域的功能上不同的染色质状态。

Protocol

所有临床标本都是按照机构审查委员会的指导方针获得的。 1. 缓冲准备 使200毫升的 TE 缓冲器 (10 毫米三盐酸, 10 毫米乙二胺乙酸 (EDTA) pH 值 8.0)。 使200毫升的圣凯瑟缓冲 (10 毫米三盐酸, 10 毫米 EDTA pH 值 8.0, 140 毫米氯化钠)。 使200毫升2.0 米甘氨酸 (37.52 克甘氨酸在200毫升水) 和加热它到65°c。 使200毫升的5% 脱氧钠 (doc) 溶液 (10 克的 doc 在200毫升水)?…

Representative Results

该协议允许免疫沉淀从冰冻肿瘤组织和细胞系, 可以在许多样本并行使用高通量方法 ( 图1A)。染色质碎片应介于 200-1000 bps 之间, 以达到最佳免疫沉淀。我们注意到, 达到相同的剪切长度所需的时间不同的组织和细胞类型。芯片的成功, 从少量的组织依赖于保持裂解冷, 特别是在超声波期间。在进行库准备之前, 应量化纯化的芯片 DN Ashould (<s…

Discussion

本协议描述了一种完整和全面的高通量芯片序列模块, 用于在人类肿瘤组织和细胞系中染色质状态的全基因图谱。在任何芯片序列协议中, 最重要的步骤之一是抗体特异性。在这里, 此方法说明了所描述的六组蛋白修改的免疫沉淀条件, 所有这些都是芯片级的, 以前在我们和其他实验室中验证过 42, 44, 45.虽然相同的抗体浓度已成?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们感谢马库斯科伊尔, 柯蒂斯 Gumbs, SMF 核心在 MDACC 的排序支持。本文所述的工作得到了 NIH 赠款 (CA016672) 对 SMF 核心和1K99CA160578 奖 (R00CA160578) 的赠款的支持, 以 k.r。

Materials

ChIP-grade H3K4me1 antibody Abcam ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody Abcam ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody Abcam ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody Abcam ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody Abcam ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody Abcam ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0 Teknova T1080
EDTA Sigma-Aldrich E9884
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich 30970
DPBS Sigma – Life Sciences D8537-500ML
SDS Sigma-Aldrich 74255
Triton-X Sigma-Aldrich X100-100ML
LiCl Sigma-Aldrich 746460
NP-40 Calbiochem 492016-100ML
1% TWEEN-20 Fisher Bioreagents BP337-500
BSA – IgG-free Sigma – Life Sciences A2058-5G
HBSS Gibo 14025092
GentleMACS C tube GentleMACS 120-008-466 disassociation tube
16% Formaldehyde Peierce 28906
miniProtease inhibitor  Roche Diagnostics 11836153001 protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G  Invitrogen 10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL Diagenode C30010011 sonication tubes
DynaMag – 96 Side Skirted Invitrogen 120.27 96-well magnetic stand
TE buffer Promega V6231
RNase A Invitrogen 12091021
Proteinase K Invitrogen 100005393
AMPure XP beads Beckman Coulter A63882 paramagnetic beads
Ethanol Sigma-Aldrich E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit Invitrogen Q32854 high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit New England BioLabs E7645L DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water Ambion AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584 high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585 high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) New England BioLabs E7335L Multiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) New England BioLabs E7500L Multiplex Oligos 
TapeStation 4200 Agilent Technologies G2991AA high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device  Diagenode B01060001 water bath disruputor
Mixer Nutator 421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad 1851196 PCR Thermal cycler
Water Bath Fisher Scientific 2322
Multichannel Pipet Denville 1003123
Tube Revolver Thermo-Scientific 88881001
96-Well Skirted Plate Eppendorf 47744-110
Allegra X-12R Centrifuge  Beckman Coulter A99464 benchtop centrifuge
Centrifuge 5424 Eppendorf 22620461 tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip) Agilent Technologies 401428
Optical tube strip caps (8x strip) Agilent Technologies 401425
Loading Tips, 10 Pk Agilent Technologies 5067-5599
IKA MS3 vortex IKA 3617000 vortex
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References

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Keywords: Chromatin StatesChIP-sequencingCancer EpigeneticsHistone ModificationsChromatin FragmentsHistone AntibodiesProtein G Magnetic BeadsChIP Dilution Buffer
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Terranova, C., Tang, M., Orouji, E., Maitituoheti, M., Raman, A., Amin, S., Liu, Z., Rai, K. An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues. J. Vis. Exp. (134), e56972, doi:10.3791/56972 (2018).
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