Интегрированная платформа для картирования генома общесистемной Chromatin государств с использованием высокопроизводительный чип последовательности в тканях опухоли
Summary
Здесь мы описываем, оптимизированный протокол чип последовательности высокой пропускной способностью и трубопровод Вычислительный анализ для определения генома общесистемной хроматина состояния моделей из замороженных опухолевых тканей и клеточных линий.
Abstract
Изменения гистона являются одним из основных компонентов epigenome и играют важную роль регулирования в определении транскрипционный анализ статуса ассоциированных локусов. Кроме того наличие конкретных изменений был использован для определения позиции и личность-кодирования функциональных элементов, таких как усилители. В последние годы иммунопреципитации chromatin, следуют следующего поколения последовательности (чип seq) стал мощным инструментом определения генома общесистемной профилей отдельных гистона модификаций. Однако это становится все более очевидным, комбинаторные шаблоны изменений chromatin, называют Chromatin государствами, определить личность и характер связанных геномной Локус. Таким образом рабочие процессы, состоящие из надежной методологии (HT) высок объём для профилирования количество меток гистона модификации, а также Вычислительный анализ трубопроводов способна обработки мириады чип-Seq профилирование наборов данных, необходимых для всеобъемлющее определение государств epigenomic в большое количество проб. HT-чип-Seq рабочего процесса, представленные здесь состоит из двух модулей: 1) экспериментальный протокол для профилирования нескольких модификаций гистона от небольших количеств образцов опухоли и клеточных линий в 96-луночных формате; и 2) вычислительные данные анализа трубопровода, который объединяет существующие инструменты для вычисления отдельные Марк размещение и комбинаторные хроматина состояние модели. Вместе эти два модуля облегчить легкая Обработка сотни образцов чип-Seq быстрым и эффективным образом. Рабочий процесс, представленные здесь используется для получения структур хроматина государства от 6 гистона Марк профилей в меланома опухоли и клеточных линий. В целом мы представляем всеобъемлющий чип seq рабочий процесс, который может быть применен к десятков образцов человека опухоли и рак клеточных линий для определения epigenomic аберраций в различных злокачественных опухолей.
Introduction
Большинство млекопитающих геномов (98-99%) состоит из некодирующих последовательностей, и эти регионы nocoding содержат нормативных элементов, известных участвовать в контроле экспрессии генов и хроматина организации1,2. В нормальной клетке конкретные Ассамблея геномной ДНК в уплотненных хроматина структура имеет решающее значение для пространственной организации, регулирования и точные сроки различных процессов, связанных с ДНК3,4,5. В раковых клеток, однако, chromatin изменения по аномальным эпигенетические механизмы может привести к неправильной Организации структуры хроматина, включая доступ к регуляторных элементов, хромосомные циклической системы и ген выражение модели6, 7,8,9,10.
Несмотря на недавние успехи мы ограничили понимание эпигеномные изменения, которые связаны с опухолевой прогрессии или терапевтического ответа. Epigenome состоит из массива изменений, в том числе меток гистона и метилирование ДНК, которые вместе образуют динамического состояния (упоминаемый как состояние хроматина), которая посягает на выражение генных сетей и других процессов, решающее значение для поддержания Сотовый личность. Недавно изменения в усилители были показаны в множественные злокачественные опухоли, изучая профили H3K27Ac11. Хотя такие исследования дают представление о корреляции изолированных эпигенетических меток, более чем 100 эпигеномные изменения были определены12,13 без четкого понимания их биологических функций и взаимозависимость. Кроме того есть еще большее количество возможных комбинаторной моделей этих гистона и модификации ДНК, и это эти комбинаторной закономерности – не отдельные модификации – диктовать эпигеномные государств14. Таким образом существует огромный необходимость выявления изменений в этих государствах хроматина в прогрессии рака или ответы на терапии. Всесторонние знания о epigenome изменений в раках отставание в части из-за технического (например , поколения крупномасштабных данных из небольшого количества клинического материала/сингл клеток) и аналитический (например алгоритмы для определения комбинаторные государства) проблемы. Таким образом ощущается насущная необходимость для надежные методы высокой пропускной способностью для профилирования большое количество марок изменения гистона из клинического материала и вычислительной подходов в реализации предсказать комбинаторной шаблоны, которые будут способствовать определение эпигеномные государств, связанных с различными этапами tumorigenesis и терапевтической резистентности. Кроме того, данные, поступившие от недавних epigenome профилирования исследования15,16,,1718,19,20,21, 22,23 в нормальных тканей и клеточных линий может быть интегрирована с профилями хроматина опухоли для дальнейшего понимание epigenome вклад биология опухоли.
Хроматин профилирования стала мощным инструментом для выявления глобальных привязки моделей различных chromatin изменения15,–24. В последние годы чип seq стал «золотым стандартом» для изучения ДНК белковых взаимодействий на глобальном масштабе25,,2627. Для любого эксперимента чип seq критические шаги необходимые для его успеха, включая обработку ткани и диссоциации, determing условий оптимального sonication, determing оптимального антитела концентрации для осадков, Библиотека подготовки, После последовательность обработки данных и анализа, ниже по течению. Каждый из этих шагов содержат ключевые качества контрольно-пропускных пунктах и когда вместе взятые, имеют решающее значение для надлежащего выявления потенциальных целей для функциональной проверки. Через инновации в эти шаги несколько предварительного исследования были разработаны методологии для выполнения чип или чип-Seq от небольшого количества ткани28,29,,3031,32 . Кроме того некоторые исследования показали, что протоколы для экспериментов чип высокой пропускной способности, следуют ПЦР на основе количественный33,34. Наконец некоторые публично доступна анализ платформы для чип-Seq данных теперь доступны как Easeq35 и36галактики. Однако хватало интегрированную платформу для выполнения чип-Seq в духе высокой пропускной способности в сочетании с вычислительной трубопровода для выполнения одной марки, а также анализы состояние хроматина.
Этот протокол описывает полный и всеобъемлющий процесс чип seq для картирования генома общесистемной государств хроматина в опухоль тканей и клеточных линий, с легко следовать руководящим принципам, охватывающий все шаги, необходимые для успешного эксперимента. Приняв метод высок объём ранее описанных Blecher Гонен et al. 37, этот протокол может быть выполнена на десятки образцов параллельно и успешно применяется на линии клеток рака и человеческих опухолей, таких как меланома, толстой кишки, простаты и глиобластомы мультиформной. Мы демонстрируем методологии для шести основных гистона модификаций, которые представляют собой основные компоненты эпигеномный нормативные ландшафт в человека меланомы клеточных линий и образцов опухоли. Эти изменения включают в себя H3K27ac (усилители), H3K4me1 (активных и готова усилители), H3K4me3 (промоутеры), H3K79me2 (транскрибируется регионов), H3K27me3 (polycomb репрессии) и H3K9me3 (гетерохроматиновые репрессии). Эти метки может использоваться отдельно или в сочетании для выявления государств функционально различных хроматина, представляющих репрессивных и активных доменов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает полный и всеобъемлющий высок объём чип seq модуль для картирования генома общесистемной государств хроматина в человека опухоли тканей и клеточных линий. В любом протоколе чип seq одним из наиболее важных шагов является специфичность антитела. Здесь этот метод ил…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Маркуса Койл, Кертис Гамбс, ядро SMF в MDACC для поддержки виртуализации. Работа, описанная в этой статье была поддержана грантов от гранта NIH (CA016672) для SMF ядро и NCI награды (1K99CA160578 и R00CA160578) к. р.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
References
- Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
- Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
- Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178 (2015).
- Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
- Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
- Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
- Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
- Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
- Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
- Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
- Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
- Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033 (2014).
- Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086 (2014).
- Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
- Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
- Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
- O’Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
- Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17 (2008).
- Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2 (2006).
- Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
- Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
- Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
- Koster, J., Rahmann, S. Snakemake–a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
- Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
- Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326 (2013).
- Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
- Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
- Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
- Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).
