Uma plataforma integrada para o mapeamento do genoma-larga de Estados da cromatina usando ChIP de alta produtividade-sequenciamento em tecidos de Tumor

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo de ChIP-sequenciamento da elevado-produção otimizado e pipeline de análises computacionais para a determinação de padrões de estado todo o genoma da cromatina de tecidos de tumor congelado e linhas celulares.

Abstract

Modificações do histone constituem um componente importante do Epigenoma e desempenham importantes funções reguladoras na determinação do estatuto transcriptional dos loci associados. Além disso, a presença de alterações específicas tem sido usada para determinar a posição e a identidade não-codificante funcional elementos como potenciadores. Nos últimos anos, a imunoprecipitação da cromatina, seguida de próxima geração sequenciação (ChIP-seq) tornou-se uma poderosa ferramenta para determinar os perfis de todo o genoma de modificações do histone individuais. No entanto, tornou-se cada vez mais claro que os padrões de combinatórios de modificações da cromatina, referidos como Estados de cromatina, determinam a identidade e a natureza do locus genômico associado. Portanto, os fluxos de trabalho consistindo de robustas metodologias de (HT) de alta produtividade para criação de perfil de um número de marcas de modificação de histona, bem como dutos de análises computacionais capazes de lidar com miríades de ChIP-Seq perfis de conjuntos de dados, são necessários para determinação abrangente dos Estados epigenomic em grande número de amostras. O HT-ChIP-Seq de fluxo de trabalho aqui apresentado é composto por dois módulos: 1) um protocolo experimental para o perfilamento várias modificações do histone de pequenas quantidades de amostras de tumor e linhas de células em um formato de 96 poços; e 2) um pipeline de análise de dados computacional que combina as ferramentas existentes para calcular tanto marca individual ocupação e padrões de estado cromatina combinatória. Juntos, esses dois módulos facilitam fácil processamento de centenas de amostras de ChIP-Seq de forma rápida e eficiente. O fluxo de trabalho apresentado aqui é usado para derivar padrões de cromatina estado 6 perfis de marca de histona em tumores de melanoma e linhas celulares. Em geral, apresentamos um fluxo de trabalho de ChIP-seq abrangente que pode ser aplicado a dezenas de amostras de tumor humano e linhas de células de câncer para determinar epigenomic de aberrações em várias malignidades.

Introduction

A maioria dos genomas de mamíferos (98-99%) é composta de sequência não-codificadoras e nestas regiões nocoding contêm elementos reguladores conhecidos para participar no controle da expressão gênica e cromatina organização^1,2. Em uma célula normal, o assembly específico do DNA genômico na estrutura da cromatina compactada é fundamental para a organização espacial, a regulação e a cronometragem precisa de vários processos de DNA associada^3,4,5. Em uma célula de câncer, no entanto, as modificações de cromatina por aberrantes mecanismos epigenéticos podem levar a organização inadequada da estrutura da cromatina, incluindo o acesso aos elementos reguladores, sistemas loop cromossômicos e de padrões de expressão de gene^{6, 7,8,9,10}.

Apesar dos avanços recentes, nós limitamos a compreensão das alterações epigenéticas que estão associados com a progressão do tumor ou resposta terapêutica. A Epigenoma consiste de uma matriz de modificações, incluindo marcas de histona e metilação de DNA, que coletivamente formam um estado dinâmico (designado Estado de cromatina) que colide com redes de expressão de gene e outros processos críticos para a manutenção identidade celular. Recentemente, alterações em potenciadores foram mostradas em várias neoplasias malignas através do estudo de perfis de H3K27Ac¹¹. Embora tais estudos fornecem insights sobre a correlação de marcas epigenéticas isoladas, mais de 100 modificações epigenéticas têm sido identificadas^12,13 , sem uma compreensão clara das suas funções biológicas e interdependência. Além disso, há um número ainda maior de possíveis padrões combinatórios destes histona e modificações de DNA, e é desses padrões combinatórios – modificações não individuais – que ditam Estados epigenéticas¹⁴. Portanto, há uma enorme necessidade de identificar alterações nestes Estados de cromatina durante a progressão do câncer ou respostas à terapia. Conhecimento abrangente das alterações Epigenoma em cânceres tem sido atrasadas em parte devido à técnica (por exemplo, a geração de dados em larga escala de pequena quantidade de células de material/única clínicas) e analítico (por exemplo, algoritmos para definir desafios de combinatória Estados). Portanto, há uma necessidade crítica de robustas métodos de alta produtividade para criação de perfil de grande número de marcas de modificação do histone de material clínico e fácil de implementar abordagens computacionais para prever padrões combinatórios que facilitará determinação da epigenéticas Estados associados com diferentes estágios de resistência terapêutica e tumorigênese. Dados complementares, disponíveis a partir do recente Epigenoma de perfil estudos^{15,16,17,18,19,20,21, 22,23} em linhas de células e tecidos normais podem ser integrados com perfis de cromatina de tumores para mais introspecções Epigenoma contribuição à biologia do tumor.

Criação de perfil de cromatina, tornou-se uma poderosa ferramenta para identificar os padrões de ligação global de cromatina várias modificações^15,24. Nos últimos anos, ChIP-seq tornou-se o “padrão ouro” para estudar interações DNA-proteína em uma escala global^25,26,27. Para qualquer experiência de ChIP-seq, existem passos críticos necessários para seu sucesso, incluindo processamento de tecido e dissociação, determinar condições optimal sonication, determinar a concentração de anticorpo para a precipitação, preparação de biblioteca, pós-sequenciamento de processamento de dados e análise a jusante. Cada um destes passos contêm pontos de verificação de chave de controle de qualidade e quando tomados em conjunto, são crucial para adequadamente, identificando potenciais alvos para validação funcional. Através da inovação nessas etapas, vários estudos prévios desenvolveram metodologias para executar o ChIP ou ChIP-Seq de pequena quantidade de tecidos^{28,29,30,31,32} . Além disso, alguns estudos têm sugerido que os protocolos para experimentos de ChIP do elevado-throughput seguidos pelo PCR baseado quantificação^33,34. Finalmente, algumas plataformas de análise disponível publicamente para ChIP-Seq dados agora estão disponíveis como Easeq³⁵ e galáxia³⁶. No entanto, uma plataforma integrada para a realização de ChIP-Seq em uma moda de alta produtividade em combinação com um encanamento computacional para executar marca única, bem como análises de estado cromatina tem faltado.

Este protocolo descreve um completo e abrangente ChIP-seq de fluxo de trabalho para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor e linhas de celular, com fácil de seguir diretrizes englobando todas as etapas necessárias para uma experiência bem sucedida. Através da adopção de um método de alta produtividade anteriormente descrito por Blecher-Gonen et al ³⁷, este protocolo pode ser executado em dezenas de amostras em paralelo e tem sido aplicado com sucesso em linhas de células de câncer e tumores humanos como melanoma, cólon, próstata e glioblastoma multiforme. Vamos demonstrar a metodologia para seis modificações do histone de núcleo que representam os principais componentes da paisagem epigenética regulamentar em linhas de células de melanoma humano e amostras de tumor. Essas modificações incluem H3K27ac (intensificadores), H3K4me1 (potenciadores de ativos e equilibrados), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiões), H3K27me3 (polycomb de repressão) e H3K9me3 (heterocromático repressão). Estas marcas podem ser usadas sozinho ou em combinação para identificar Estados de cromatina funcionalmente distintos que representam domínios repressivos e ativos.

Protocol

Todas as amostras clínicas foram obtidas seguindo as orientações do Conselho de revisão institucional. 1. preparação buffer Fazer 200 mL de tampão TE (Tris-HCl, pH de ácido (EDTA) de ácido etilenodiaminotetracético 10mm 8.0 de 10 mM). Fazer 200 mL de tampão STE (10 mM Tris-HCl, pH de EDTA 10 mM 8.0, 140 mM de NaCl). Fazer 200 mL de glicina 2,0 M (37,52 g de glicina em 200 mL de água) e aquecê-lo a 65 ° C. Fazer 200 mL de solução a 5% de s…

Representative Results

Este protocolo permite a imunoprecipitação de tecidos de tumor congelado e linhas celulares que podem ser executadas em dezenas de amostras em paralelo usando um método de alta produtividade (figura 1A). Fragmentos de cromatina devem variar entre ~ 200-1000 bps para a imunoprecipitação ideal. Temos observado que o tempo necessário para atingir o mesmo comprimento de corte é diferente para diferentes tecidos e tipos de células. O suces…

Discussion

Este protocolo descreve um módulo de ChIP-seq da elevado-produção completo e abrangente para o mapeamento de todo o genoma de Estados da cromatina em tecidos de tumor humano e linhas celulares. Em qualquer protocolo de ChIP-seq, um dos passos mais importantes é a especificidade do anticorpo. Aqui, esse método ilustra imunoprecipitação condições para as modificações do histone seis descritos, os quais são ChIP-grau e validados anteriormente em nosso e outros laboratórios^42,<…

Materials

ChIP-grade H3K4me1 antibody	Abcam	ab8895
ChIP-grade H3K27ac antibody	Abcam	ab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibody	Abcam	ab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibody	Abcam	ab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibody	Abcam	ab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibody	Abcam	ab8898
1M Tris HCl, pH 8.0	Teknova	T1080
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	30970
DPBS	Sigma – Life Sciences	D8537-500ML
SDS	Sigma-Aldrich	74255
Triton-X	Sigma-Aldrich	X100-100ML
LiCl	Sigma-Aldrich	746460
NP-40	Calbiochem	492016-100ML
1% TWEEN-20	Fisher Bioreagents	BP337-500
BSA – IgG-free	Sigma – Life Sciences	A2058-5G
HBSS	Gibo	14025092
GentleMACS C tube	GentleMACS	120-008-466	disassociation tube
16% Formaldehyde	Peierce	28906
miniProtease inhibitor	Roche Diagnostics	11836153001	protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mL	Diagenode	C30010011	sonication tubes
DynaMag – 96 Side Skirted	Invitrogen	120.27	96-well magnetic stand
TE buffer	Promega	V6231
RNase A	Invitrogen	12091021
Proteinase K	Invitrogen	100005393
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63882	paramagnetic beads
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q32854	high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit	New England BioLabs	E7645L	DNA Library Prep Kit
Nuclease-free water	Ambion	AM9932
High sensitivity D1000 ScreenTape	Agilent Technologies	5067-5584	high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagents	Agilent Technologies	5067-5585	high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)	New England BioLabs	E7335L	Multiplex Oligos
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)	New England BioLabs	E7500L	Multiplex Oligos
TapeStation 4200	Agilent Technologies	G2991AA	high sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device	Diagenode	B01060001	water bath disruputor
Mixer	Nutator	421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1851196	PCR Thermal cycler
Water Bath	Fisher Scientific	2322
Multichannel Pipet	Denville	1003123
Tube Revolver	Thermo-Scientific	88881001
96-Well Skirted Plate	Eppendorf	47744-110
Allegra X-12R Centrifuge	Beckman Coulter	A99464	benchtop centrifuge
Centrifuge 5424	Eppendorf	22620461	tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)	Agilent Technologies	401428
Optical tube strip caps (8x strip)	Agilent Technologies	401425
Loading Tips, 10 Pk	Agilent Technologies	5067-5599
IKA MS3 vortex	IKA	3617000	vortex