Una plataforma integrada para la asignación de todo el genoma de cromatina Estados mediante secuenciación del ChIP de alto rendimiento en los tejidos del Tumor
Summary
Aquí, describimos un protocolo de secuencia de ChIP de alto rendimiento optimizado y tubería de análisis computacional para la determinación de patrones de estado de todo el genoma cromatina de líneas celulares y tejidos del tumor congelado.
Abstract
Modificaciones de las histonas constituyen un componente importante del epigenoma y desempeñan importantes funciones reguladoras para determinar el estado transcripcional de loci asociados. Además, la presencia de modificaciones específicas se ha utilizado para determinar la posición y elementos funcionales no codificante de identidad como potenciadores. En los últimos años, seguida por la secuencia de generación siguiente (ChIP-seq) de inmunoprecipitación de cromatina se ha convertido en una poderosa herramienta en la determinación de los perfiles de genoma de modificaciones de las histonas individuales. Sin embargo, se ha vuelto cada vez más claro que los patrones combinatorios de modificaciones de la cromatina, denominados Estados de cromatina, determinan la identidad y la naturaleza del locus genómico asociado. Por lo tanto, los flujos de trabajo de sólidas metodologías de (HT) de alto rendimiento para perfilar una serie de marcas de modificación de las histonas, así como tuberías de análisis computacional capaces de manejar miríadas de ChIP-Seq perfiles conjuntos de datos, son necesarios para determinación integral de epigenómica Estados en gran número de muestras. Flujo de trabajo de la HT-ChIP-Seq presentada consta de dos módulos: 1) un protocolo experimental para perfilar varias modificaciones de la histona de pequeñas cantidades de muestras tumorales y líneas celulares en un formato de 96 pozos; y 2) una tubería de análisis computacional de datos que combina las herramientas existentes para calcular combinatoria cromatina estado patrones y ocupación de cada marca. Juntos, estos dos módulos facilitan el fácil procesamiento de cientos de muestras de ChIP-Seq en forma rápida y eficiente. El flujo de trabajo que presentamos se utiliza para derivar patrones de cromatina estado de 6 perfiles de marca de las histonas en melanoma tumores y líneas celulares. En general, se presenta un flujo de trabajo de ChIP-seq integral que puede aplicarse a decenas de muestras de tumores humanos y líneas celulares de cáncer para determinar aberraciones epigenómicas en varias malignidades.
Introduction
La mayoría de los genomas mamíferos (98-99%) se compone de secuencia codifica, y estas regiones nocoding contienen elementos reguladores que participan en el control de la expresión génica y cromatina organización1,2. En una célula normal, el conjunto específico de la DNA genomic en estructura de la cromatina compactada es crítico para la organización espacial, la regulación y sincronización precisa de diversos procesos asociados de ADN3,4,5. En una célula cancerosa sin embargo, modificaciones de la cromatina por mecanismos epigenéticos aberrantes pueden llevar a la inadecuada organización de la estructura de la cromatina, incluido el acceso a elementos reguladores, sistemas de bucles cromosómicos y gene expresión patrones6, 7,8,9,10.
A pesar de los avances recientes, hemos limitado entendimiento de las alteraciones epigenéticas que se asocian a progresión del tumor o la respuesta terapéutica. El epigenoma consiste en una serie de modificaciones, incluyendo marcas de histonas y la metilación del ADN, que forman colectivamente un estado dinámico (denominado estado de cromatina) que inmiscuye en redes de expresión de genes y otros procesos críticos para el mantenimiento de identidad celular. Recientemente, alteraciones en potenciadores se han demostrado en múltiples neoplasias malignas mediante el estudio de perfiles de H3K27Ac11. Aunque tales estudios proporcionan la penetración en la correlación de las marcas epigenéticas aisladas, más de 100 modificaciones epigenéticas han sido identificados12,13 sin el claro entendimiento de sus papeles biológicos y interdependencia. Además, hay un número aún mayor de posibles patrones combinatorios de estas histonas y ADN modificaciones y es estos patrones combinatorios – modificaciones no individuales – que dictan Estados epigenéticos14. Por lo tanto, hay una tremenda necesidad de identificar alteraciones en estos Estados de cromatina durante la progresión del cáncer o la respuesta a la terapia. Amplio conocimiento de las alteraciones del epigenoma en cánceres ha sido rezagadas en parte debido a la técnica (por ejemplo, generación de datos a gran escala de pequeña cantidad de células solo material clínicas) y analíticos (por ejemplo, algoritmos para definir problemas de combinatoria de Estados). Por lo tanto, hay una necesidad crítica de métodos robustos de alto rendimiento para perfiles de gran número de marcas de modificación de las histonas de material clínico y fácil de implementar enfoques computacionales para predecir patrones combinatorios que facilitará determinación de Estados epigenéticos asociados a diferentes etapas de la tumorigénesis y resistencia a la terapéutica. Además, datos recientes epigenoma perfilado estudios15,16,17,18,19,20,21, 22,23 en tejidos normales y líneas celulares puede ser integrado con los perfiles de la cromatina de tumores para mayores revelaciones en el epigenoma contribución a la biología del tumor.
Cromatina de perfiles se ha convertido en una poderosa herramienta para la identificación de los patrones de enlace global de diferentes modificaciones de la cromatina15,24. En los últimos años, ChIP-seq se ha convertido en el “gold standard” para el estudio de las interacciones DNA-proteína en una escala global25,26,27. Para cualquier experimento de ChIP-seq, son pasos críticos necesarios para su éxito, incluyendo la disociación y el procesamiento de tejido, determinar condiciones óptimas de sonicación, determinar la concentración óptima del anticuerpo para precipitación, preparación de la biblioteca, la secuencia de procesamiento de datos y posteriores análisis. Cada uno de estos pasos contienen puntos clave de control de calidad y en conjunto, son crucial para correctamente identificar posibles objetivos para la validación funcional. A través de la innovación en estos pasos, varios estudios anteriores han desarrollado metodologías para realizar el ChIP o ChIP-Seq de pequeña cantidad de tejidos28,29,30,31,32 . Además, algunos estudios han sugerido protocolos para experimentos de ChIP de alto rendimiento seguidos de PCR basado en la cuantificación de33,34. Finalmente, algunas plataformas de análisis disponible públicamente para ChIP-Seq datos ahora están disponibles como Easeq35 y36de la galaxia. Sin embargo, ha faltado una plataforma integrada para realizar ChIP-Seq en un modo de alto rendimiento en combinación con una tubería computacional para realizar la sola marca así como el análisis del estado de cromatina.
Este protocolo describe un flujo completo e integral de ChIP-seq para el mapeo del genoma de Estados de la cromatina en los tejidos del tumor y líneas celulares, con fácil seguir las pautas que abarca todos los pasos necesarios para un exitoso experimento. Mediante la adopción de un método de alto rendimiento previamente descrito por Blecher-Gonen et al. 37, este protocolo puede realizarse en decenas de muestras en paralelo y se ha aplicado con éxito en líneas celulares de cáncer y tumores humanos como melanoma, colon, próstata y multiforme del glioblastoma. Se demuestra la metodología de seis modificaciones de las histonas del core que representan componentes claves del paisaje regulación epigenético en líneas celulares de melanoma humano y muestras tumorales. Estas modificaciones incluyen H3K27ac (potenciadores), H3K4me1 (potenciadores activos y listos), H3K4me3 (promotores), H3K79me2 (transcrito regiones), H3K27me3 (polycomb represión) y H3K9me3 (heterochromatic represión). Estas marcas pueden utilizarse solo o en combinación para identificar Estados de cromatina funcionalmente distintas que representan ámbitos represivos y activadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un módulo de ChIP-seq alto rendimiento completo e integral para la asignación de todo el genoma de Estados de cromatina en líneas celulares y tejidos del tumor humano. En cualquier protocolo de ChIP-seq, uno de los pasos más importantes es la especificidad del anticuerpo. Aquí, este método ilustra las condiciones de la inmunoprecipitación de las describe seis modificaciones de las histonas, las cuales son de ChIP-grado y han sido previamente validadas en nuestro y otros laboratorios<sup cla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Marcus Coyle, Curtis Gumbs, núcleo de SMF en el MDACC para apoyo de la secuencia. El trabajo descrito en este artículo fue apoyado por subvenciones de la subvención del NIH (CA016672) a base de SMF y NCI premios (1K99CA160578 y R00CA160578) para K. R.
Materials
| ChIP-grade H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
| ChIP-grade H3K27ac antibody | Abcam | ab4729 | |
| ChIP-grade H3K4me3 antibody | Abcam | ab8580 | |
| ChIP-grade H3K79me2 antibody | Abcam | ab3594 | |
| ChIP-grade H3K27me3 antibody | Abcam | ab6002 | |
| ChIP-grade H3K9me3 antibody | Abcam | ab8898 | |
| 1M Tris HCl, pH 8.0 | Teknova | T1080 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DPBS | Sigma – Life Sciences | D8537-500ML | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | 746460 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016-100ML | |
| 1% TWEEN-20 | Fisher Bioreagents | BP337-500 | |
| BSA – IgG-free | Sigma – Life Sciences | A2058-5G | |
| HBSS | Gibo | 14025092 | |
| GentleMACS C tube | GentleMACS | 120-008-466 | disassociation tube |
| 16% Formaldehyde | Peierce | 28906 | |
| miniProtease inhibitor | Roche Diagnostics | 11836153001 | protease inhibitor tablets |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10009D | |
| Bioruptor NGS tubes 0.65 mL | Diagenode | C30010011 | sonication tubes |
| DynaMag – 96 Side Skirted | Invitrogen | 120.27 | 96-well magnetic stand |
| TE buffer | Promega | V6231 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091021 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 100005393 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63882 | paramagnetic beads |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Qubit ds DNA High Sensitivity Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA reagents |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | New England BioLabs | E7645L | DNA Library Prep Kit |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
| High sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | high sensitivity DNA reagents |
| High sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | high sensitivity DNA reagents |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 1) | New England BioLabs | E7335L | Multiplex Oligos |
| Multiplex Oligos (Index primers- Set 2) | New England BioLabs | E7500L | Multiplex Oligos |
| TapeStation 4200 | Agilent Technologies | G2991AA | high sensitivity DNA electropherogram instrument |
| Bioruptor Pico sonication device | Diagenode | B01060001 | water bath disruputor |
| Mixer | Nutator | 421105 | |
| Bio-Rad C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851196 | PCR Thermal cycler |
| Water Bath | Fisher Scientific | 2322 | |
| Multichannel Pipet | Denville | 1003123 | |
| Tube Revolver | Thermo-Scientific | 88881001 | |
| 96-Well Skirted Plate | Eppendorf | 47744-110 | |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | A99464 | benchtop centrifuge |
| Centrifuge 5424 | Eppendorf | 22620461 | tabletop centrifuge |
| Optical tube strips (8x Strip) | Agilent Technologies | 401428 | |
| Optical tube strip caps (8x strip) | Agilent Technologies | 401425 | |
| Loading Tips, 10 Pk | Agilent Technologies | 5067-5599 | |
| IKA MS3 vortex | IKA | 3617000 | vortex |
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