Fonctionnalisation de surface des nanoparticules de Virus de l’hépatite E à l’aide de méthodes chimiques de conjugaison
Summary
Nous avons conçu la protéine de capside du virus de l’hépatite E comme une NANOPARTICULE théranostiques (HEVNP). HEVNP auto assemble dans une cage icosaédrique stable en livraison muqueuse. Nous décrivons ici la modification de HEVNPs pour tumeur ciblage par mutation exposés à la surface des résidus cystéines, qui conjugue des ligands synthétiques qui lient spécifiquement les cellules tumorales.
Abstract
Pseudo-particules virales (VLP) ont servi de nanocarriers à afficher des épitopes étrangers et/ou livrer de petites molécules dans la détection et le traitement de diverses maladies. Cette application s’appuie sur la modification génétique, l’auto-assemblage et conjugaison de cystéine pour remplir l’application ciblage tumoral de recombinant VLP. comparés avec génétique modification seul, chimique conjugaison de peptides étrangers les PPV offre une significative avantage car elle permet une variété d’entités telles que les peptides synthétiques ou des oligosaccharides, à être conjugués à la surface du PPV de manière modulée et flexible, sans altération de l’Assemblée VLP.
Ici, nous démontrons comment utiliser la virus de l’hépatite E virus NANOPARTICULE (HEVNP), une capsule de théranostiques modularisée, comme un transporteur livraison multifonctionnel. Les fonctions de HEVNPs incluent ciblage tissulaire, l’imagerie et livraison thérapeutique. Basé sur les recherches structurales bien établie de HEVNP, les résidus structurellement indépendants et exposés à la surface ont été sélectionnés pour le remplacement de la cystéine comme sites de conjugaison pour groupes chimiques maléimide liés par l’intermédiaire de liens thiol-sélective. Une notamment cystéine-modification HEVNP (remplacement de l’asparagine à 573 Cys aa HEVNP – 573C) était conjugué à un ligand spécifique des cellules du cancer du sein LXY30 et marqués par agent de fluorescence proche infrarouge (NIR) (Cy5.5), rendant la tumeur ciblées HEVNPs sous forme de capsules de diagnostics efficaces (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Ingénierie des stratégies similaires peuvent être utilisés avec d’autres complexes macromoléculaires avec la structure atomique bien connue à explorer des applications potentielles dans la livraison de théranostiques.
Introduction
Le développement de vecteurs de taille nanométrique dans livraison thérapeutique et diagnostique, connu comme nanotheranostics, a déplacé une grande partie du domaine biomédical, loin des traitements généralisés sur CIBLEE1. Livraison nanotheranostic ciblées intègre des vecteurs de taille nanométrique (nanoparticules) avec des molécules de théranostiques pour diriger stablement théranostiques molécules à un tissu malade spécifique ou voie biochimique2,3,4 . Nanomédecine est venu au premier plan de l’administration ciblée parce que la tailles optimale des nanoparticules ont la capacité de stabiliser la circulation des molécules théranostiques et cibler sélectivement les molécules de surface cellulaire présentés sur les tissus malades. Nombreuses plates-formes nanotheranostic souffrent encore de l’apport des cellules passives, la dégradation prématurée, toxicité et insuffisante association avec des molécules de théranostiques. VLP surmonter bon nombre de ces obstacles dans l’administration ciblée. Ils ont été utilisés comme nanocarriers a representer les épitopes étrangers et/ou livrer de petites molécules : un régime qui peut être utilisé pour lutter contre de nombreuses maladies1. Cette application s’appuie principalement sur la propriété d’auto-assemblage ainsi que la facilité des modifications génétiques, pour remplir l’application conçue pour le PPV donnée. Par rapport au génie génétique, conjugaison chimique des peptides étrangers à VLP affiche un avantage important car il permet une grande variété d’entités, telles que des peptides ou des oligosaccharides, à être conjugués à la surface du PPV dans un modulé et avec souplesse sans altération de l’Assemblée VLP.
HEVNPs, dérivés de la protéine de capside recombinante HEV, 2nd ouvert cadre (ORF2) de lecture, sont non infectieuses auto-assemblage capsides capables de liaison cellulaire et l’entrée. Parce que HEV évolué pour la transmission de la muqueuse, la protéine de capside assemblé est de même stable en conditions muqueux protéolytique et acide5. HEVNPs forment un creux, T = 1 capside icosaédrique, composé de 60 unités identiques6,7 de ORF2, rendant extrêmement stable en stockage et en dures conditions physiologiques. Absence de tout élément génétique virale, la production efficace, haut rendement se faite par système d’expression baculovirus dans des cellules d’insecte. En raison de leur stabilité protéolytique, HEVNPs auto-assemblées sont extrait et purifiés de surnageant de la cellule, réduit considérablement les étapes de purification nécessaire. En outre, les HEVNPs possèdent un surface exposée saillie domaine (P) relié par une charnière flexible à une base stable icosaédrique. Le domaine P forme pointes surface exposée au sommet de la base icosaédrique tandis que la charnière flexible permet de modifier de façon significative le domaine P sans compromettre la base structure icosaédrique. Avec 60 unités répétées, seule modification spécifique résulte en 60 sites symétriques pour la modulation chimique. Récemment, nous avons proposé une nano-plate-forme à l’aide de HEVNP qui peut conjuguer chimiquement ligands ou petites molécules pour les applications théranostiques. Ceci a été réalisé en substituant un seul acide aminé cystéine sur le domaine de la protrusion de la HEV-VLP comme un site de réaction avec les peptides liés maléimide ou molécules. Basé sur l’analyse structurelle précédente de HEV-VLP et bien étudiés épitopes immunogènes8,9, suivant cinq acides aminés HEV-VLP ont été remplacés avec la cystéine comme des candidats potentiels : Y485C, T489C, S533C, N573C et T586C ( Figure 1). Après expression et purification de cellules d’insectes, leurs formations de VLP ont été confirmées par l’observation de microscopie électronique (met) de transmission (Figure 2), et les sites de cystéine exposés ont été analysés par Western blot après biotine maléimide liés conjugaison (Figure 2). Parmi les cinq mutants, HEVNP – 573C affiche le signal le plus fort de la conjugaison maléimide-biotine (Figure 2) et a été utilisé pour le suivi de démonstration comme le nanocarrier pour cellule de cancer du sein ciblant4 (Figure 3).
Ce protocole décrit les méthodes chimiques de conjugaison pour fixer les molécules cibles tumorales à HEVNPs grâce à la conjugaison de cystéine surface. Nous détaillons la conjugaison de molécules ciblant et détection de tumeur pour la livraison de la tumeur avec HEVNPs recombinants contenant une cystéine à N573 (573C – HEVNP). Nous nous sommes concentrés sur un processus de conjugaison de chimie de clic en deux étapes pour lier une tumeur de cancer du sein ciblage peptide, LXY3010 d’HEVNPs de forme LXY30-HEVNP (Figure 4). Par la suite, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 ont été conjugués sur le site de Lys distinct sur HEVNPs construire LXY30-HEVNP-Cy5.5 pour la détection par fluorescence les deux in vitro (Figure 5) et in vivo4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Contrairement à la procédure de votre temps de génie génétique, qui prend généralement semaines, nous démontrons simple en deux étapes et procédures de conjugaison chimique en une seule étape, ce qui peuvent être complétées en 3 jours, d’ajouter le cancer en ciblant les ligands et/ou colorant de détection fluorescence aux sites Cys/Lys de HEVNPs. La technique peut être utilisée pour dépister la meilleure cible de ligand d’un bassin de candidats et donc met à profit les services de synthèse disponi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent le parrainage du financement de RHC de NIH accorder #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, Institut National de l’alimentation et l’Agriculture, ainsi que le programme de l’éminent professeur en Finlande.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
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