Functionalization superfície de nanopartículas de vírus de hepatite E usando métodos de conjugação química
Summary
Temos engenharia da proteína do capsídeo do vírus de hepatite E como um theranostic de nanopartículas (HEVNP). HEVNP auto monta em uma gaiola icosahedral estável na entrega da mucosa. Aqui, descrevemos a modificação do HEVNPs para tumor definião mutando superfície exposta resíduos de cisteínas, que conjugue ligantes sintéticos que se ligam especificamente as células do tumor.
Abstract
Partículas vírus-like (VLP) tem sido usadas como nanocarriers para exibir resumos estrangeiros e/ou entregar pequenas moléculas na detecção e tratamento de várias doenças. Esta aplicação baseia-se na modificação genética, auto-montagem, e conjugação de cisteína para cumprir a aplicação multiplataforma em tumor de VLPs recombinantes. comparado com genética conjugação sozinho, química de modificação dos peptides extrangeiros para VIPs oferece uma significativa vantagem, porque permite uma variedade de entidades, tais como peptídeos sintéticos ou oligossacarídeos, para ser conjugada com a superfície de VIPs de forma modulada e flexível, sem alteração da Assembleia VIP.
Aqui, demonstramos como utilizar a hepatite E vírus de nanopartículas (HEVNP), uma cápsula de theranostic modularizado, como um portador de entrega multifuncional. HEVNPs funções tecido-alvo, imagem e entrega terapêutica. Baseado na pesquisa estrutural bem estabelecida do HEVNP, os resíduos estruturalmente independentes e superfície exposta foram selecionados para substituição de cisteína como sites de conjugação para grupos químicos maleimide ligados através de ligações tiol-seletivo. Um particular cisteína-modificado HEVNP (substituto da asparagina em 573 Cys aa HEVNP – 573C) foi conjugada com um ligante de célula específica de câncer de mama, LXY30 e rotulados com tintura infravermelho próximo (NIR) fluorescência (Cy5.5), tornando o tumor-alvo HEVNPs como cápsulas de diagnósticos eficazes (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Estratégias de engenharia semelhantes podem ser empregadas com outros complexos macromoleculares com estruturas atômicas conhecidas para explorar potenciais aplicações na entrega de theranostic.
Introduction
O desenvolvimento de vetores nanométricas em entrega de diagnóstica e terapêutica, conhecida como nanotheranostics, deslocou-se muito do campo biomédico longe tratamentos generalizados no sentido de alvo entrega1. Nanotheranostic alvo entrega nanométricas vetores (nanopartículas) integra-se com moléculas de theranostic para direcionar estàvel theranostic moléculas de um determinado tecido doente ou via metabólica2,3,4 . Nanomedicina chegou para a vanguarda da entrega alvo porque otimamente tamanhos nanopartículas têm capacidade para estabilizar a circulação de moléculas de theranostic e alvejar seletivamente moléculas de superfície celular apresentadas sobre os tecidos doentes. Muitas plataformas nanotheranostic ainda sofrem absorção passiva de célula, degradação pre-maturo, toxicidade e insuficiente associação com moléculas de theranostic. Os VIPs superar muitos desses obstáculos na entrega do alvo. Eles têm sido usados como nanocarriers para exibir resumos estrangeiros e/ou entregar as moléculas pequenas: um regime que pode ser usado para combater muitas doenças1. Esta aplicação depende, principalmente, de propriedade de auto-montagem, bem como a facilidade de modificações genéticas, para cumprir o aplicativo projetado para o VIP determinado. Comparado a engenharia genética, química conjugação dos peptides extrangeiros para VIP exibe uma vantagem significativa porque permite uma grande variedade de entidades, tais como peptídeos ou oligossacarídeos, para ser conjugada com a superfície de VIPs em um modulado e forma flexível, sem alteração do conjunto de VIP.
HEVNPs, derivados da proteína do capsídeo HEV recombinante, 2nd aberto lendo quadro (ORF2), são não-infecciosas, montagem auto capsids capazes de ligação de celular e entrada. Porque HEV evoluiu para a transmissão da mucosa, a proteína de capsídeo montado é da mesma forma estável em condições da mucosa proteolíticas e ácida5. HEVNPs formam uma cavidade, T = 1 capsídeo icosaédrica, composto de 60 unidades idênticas6,7 de ORF2, tornando-o altamente estável tanto em armazenamento e em duras condições fisiológicas. Faltando alguma elementos genéticos virais, a rendimento eficiente, de alta produção é conseguida com baculovirus sistema de expressão em células de inseto. Por causa de sua estabilidade proteolítica, Self montados HEVNPs são extraídos e purificados do sobrenadante de célula, reduzindo substancialmente as etapas de purificação necessário. Além disso, HEVNPs possuem um superfície exposta protrusão domínio (P) conectado através de uma articulação flexível para uma base estável icosaédrica. O domínio P forma picos de superfície exposta no topo da base icosahedral enquanto a dobradiça flexível torna possível modificar significativamente o domínio P sem comprometer a estrutura icosaédrica base. Com 60 unidades repetidas, única site-specific modificação resulta em 60 locais simétricas para modulação de química. Recentemente, propusemos uma nano-plataforma usando o HEVNP que pode conjugado quimicamente ligantes ou pequenas moléculas para aplicações theranostic. Isto foi conseguido substituindo um único aminoácido cisteína no domínio de protrusão de HEV-VIP como um site de reação com maleimide-lig peptídeos ou moléculas. Com base na anterior análise estrutural de HEV-VIP e bem estudado epitopos imunogénicos8,9, os seguintes cinco HEV-VIP aminoácidos foram substituídos com cisteína como potenciais candidatos: Y485C, T489C, S533C, N573C e T586C ( Figura 1). Depois da expressão e purificação de células de inseto, suas formações VIP foram confirmadas pela observação de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão (Figura 2), e os sites de cisteína expostos foram analisados por Western blot após biotina maleimide-lig conjugação (Figura 2). Entre os cinco mutantes, HEVNP – 573C exibido o sinal mais forte da conjugação maleimide-biotina (Figura 2) e foi usado para acompanhamento demonstração como o nanocarreador para célula de câncer de mama visando4 (Figura 3).
Este protocolo descreve métodos de conjugação química para anexar moléculas tumor-direcionamento para HEVNPs através da conjugação de superfície cisteína. Detalhamos a conjugação das moléculas de direcionamento e deteção de tumor para entrega do tumor com HEVNPs recombinantes contendo uma cisteína em N573 (HEVNP – 573C). Focamos em um processo de conjugação de química clique duas etapas para vincular um tumor de câncer de mama direcionamento do peptide, LXY3010 de HEVNPs de forma LXY30-HEVNP (Figura 4). Posteriormente, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 foram conjugados para o site de Lys separado na HEVNPs para construir LXY30-HEVNP-Cy5.5 para a deteção fluorescente, tanto em vitro (Figura 5) e em vivo4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em contraste com o procedimento demorado a engenharia genética, que normalmente leva semanas, aqui podemos demonstrar duas etapas simples e procedimentos de conjugação química uma etapa, que podem ser concluídos no prazo de 3 dias, adicionando o câncer visando ligante e/ou tintura de deteção de fluorescência para os sites de Cys/Lys de HEVNPs. A técnica pode ser usada a tela para o melhor destino de ligante de um pool de candidatos e assim, aproveita-se dos serviços disponíveis do peptide/pequena molécula s?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem o patrocínio do financiamento a RHC pelo NIH conceder #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, Instituto Nacional de alimentação e agricultura, bem como o programa distinto Professor Finlândia.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
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