Поверхности функционализации наночастиц вирус гепатита Е, используя методы химической спряжение
Summary
Мы инженерии капсульных белков вируса гепатита Е как наночастиц theranostic (HEVNP). HEVNP самостоятельно собирает в стабильной икосаэдра клетку в слизистой доставки. Здесь мы описываем изменения HEVNPs для ориентации, мутирует поверхности подвергаются остатков, к которым, которые конъюгат синтетическими лигандами, конкретно привязанные опухолевых клеток опухоли.
Abstract
Вирусоподобных частиц (VLP) использовали как nanocarriers для отображения иностранных эпитопов или доставить небольшие молекулы в обнаружения и лечения различных заболеваний. Это приложение полагается на генетической модификации, самостоятельной сборки, и хвоща спряжение выполнить против опухоли применение рекомбинантного VLP. по сравнению с генетической модификации одиночку, химические спряжение иностранных пептидов VLP предлагает значительное преимущество, потому что она позволяет целый ряд организаций, таких как синтетических пептидов или олигосахариды, чтобы конъюгированных на поверхности VLP модулированных и гибким образом без изменений VLP Ассамблеи.
Здесь мы продемонстрируем использование наночастиц вирус гепатита E (HEVNP), Модульная theranostic капсулу, как многофункциональный доставки перевозчиком. Функции HEVNPs включают ткани таргетинг, визуализации и терапевтические доставки. На основе устоявшихся структурных исследований HEVNP, структурно независимым и открытые поверхности остатки были отобраны для хвоща замены как спряжение сайты для maleimide связаны химических групп через тиоловых селективный связей. Один частности хвоща модифицированных HEVNP (замена Cys аспарагина в 573 aa (HEVNP – 573C)) был конъюгированных к груди рак клеток конкретных лиганд, LXY30 и помечены с ближней ИК-области спектра (NIR) флуоресценции краситель (Cy5.5), визуализации, опухоль целевой HEVNPs как эффективный диагностический капсулы (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Подобные инженерной стратегии могут быть использованы с другими макромолекулярных комплексов с известным атомных структур для изучения потенциальных приложений в theranostic доставки.
Introduction
Развитие нано размера векторов в лечебных и диагностических доставки, известный как nanotheranostics, изменилось многое из области биомедицины от обобщенных процедур к целенаправленной доставки1. Целевые nanotheranostic доставки интегрирует нано размера вектора (наночастиц) с theranostic молекулами стабильно прямого theranostic молекулы к конкретным больные ткани или биохимические пути2,3,4 . Наномедицина пришел на первый план целенаправленной доставки, потому что оптимально размеров наночастиц имеют способность стабилизировать распространение theranostic молекул и выборочно целевых клеток поверхности молекул, представленные на пораженные ткани. Многие nanotheranostic платформах по-прежнему страдают от пассивного клеток поглощения, предварительно пожилые деградации, токсичности и недостаточно ассоциации с theranostic молекулами. VLP преодолеть многие из этих препятствий в целенаправленной доставки. Они использовали как nanocarriers для отображения иностранных эпитопов или доставить небольшие молекулы: режим, который может использоваться для борьбы с многих заболеваний1. Это приложение полагается главным образом на имущество самостоятельной сборки, а также простота генетических изменений, выполнить разработанные приложения для данного VLP. По сравнению с генной инженерии, химические спряжение иностранных пептидов в ВЛП отображает значительное преимущество, потому что она позволяет множество сущностей, например пептидов или олигосахариды, чтобы конъюгированных на поверхности VLP в модулированных и гибко без изменений VLP Ассамблеи.
HEVNPs, производные от Рекомбинантный белок капсид ГЭМ, 2-й открытый чтение фрейма (ORF2), неинфекционных, самостоятельной сборки capsids, способный клеток привязки и вход. Потому что HEV эволюционировали для слизистой передачи, собранный капсид белок аналогично стабилен в протеолитические и кислой слизистой условия5. HEVNPs образуют дупло, T = 1 икосаэдра капсида, состоящий из 60 идентичных блоков6,7 ORF2, делает его весьма стабильным, как хранения, так и в суровых условиях физиологических. Отсутствие любой вирусный генетические элементы, производство эффективной, высокая урожайность достигается через бакуловирусы выражение системы в клетках насекомых. Из-за их протеолитических стабильности, собственн-собранные HEVNPs извлекаются и очищенной от клеток супернатанта, существенно снижая необходимой очистки шагов. Кроме того HEVNPs обладают поверхности подвергаются выступ домена (P) подключен через гибкий шарнир стабильную базу икосаэдра. P домен формы поверхности подвергаются шипы на вершине икосаэдра базы в то время как гибкая петля позволяет значительно изменить домен P без ущерба для базовой структуры икосаэдра. С 60 неоднократные единиц один участкам модифицирование приводит в 60 симметричный сайтов для химического модуляции. Недавно мы предложили нано платформу с помощью HEVNP, которая может химически конъюгат лигандами или малых молекул для theranostic приложений. Это было достигнуто путем замены одной Аминокислоты цистеина на выступ домена HEV-VLP как реакция сайт с связаны maleimide пептидами или молекул. Основываясь на предыдущих структурный анализ HEV-VLP и хорошо изучена иммуногенность epitopes8,9, следующих пяти HEV-VLP аминокислоты были заменены хвоща как потенциальных кандидатов: Y485C, T489C, S533C, N573C и T586C ( Рисунок 1). После очистки от насекомых клеток и выражение, их VLP образований были подтверждены передачи электронной микроскопии (ТЕА) наблюдения (рис. 2), и подвергаются хвоща сайты были проанализированы Западной пятно после maleimide связаны биотин Спряжение (рис. 2). Среди пяти мутантов HEVNP – 573C отображается сильный сигнал maleimide биотин спряжение (рис. 2) и был использован для последующих демонстрации как nanocarrier для клетки рака груди на4 (рис. 3).
Этот протокол описывает методы химической спряжение придавать HEVNPs опухоль ориентация молекул путем сопряжения поверхности цистеина. Мы подробно спряжение опухоли обнаружения и ориентации молекул для доставки опухоли с рекомбинантным HEVNPs, содержащий цистеина в N573 (HEVNP – 573C). Мы сосредоточились на двухэтапный нажмите химии спряжение процесс привязки опухоли рака молочной железы, ориентация пептид, LXY3010 HEVNPs в форме LXY30-HEVNP (рис. 4). Впоследствии, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 были конъюгированных на отдельный сайт Lys на HEVNPs построить LXY30-HEVNP-Cy5.5 флуоресцентного обнаружения как в пробирке (рис. 5) и в естественных условиях4.
Protocol
Representative Results
Discussion
В отличие от времени генной инженерии процедура, которая обычно занимает недели, здесь мы демонстрации простой двухэтапный и одношаговые химических спряжение процедур, которые могут быть завершены в течение 3 дней, добавления рака, ориентация лиганда и/или флуоресценции обнаружения к?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают спонсорство финансирование RHC по НИЗ Грант #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, Национальный институт продовольствия и сельского хозяйства, а также Финляндия заслуженный профессор программы.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
- Ludwig, C., Wagner, R. Virus-like particles-universal molecular toolboxes. Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).
- Galaway, F. A., Stockley, P. G. MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform. Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).
- Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. Virus-based nanocarriers for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).
- Chen, C. C., et al. Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting. Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).
- Jariyapong, P., et al. Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery. Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).
- Xing, L., et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes. Virology. 265 (1), 35-45 (1999).
- Li, T. C., et al. Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).
- Xing, L., et al. Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway. J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).
- Xing, L., et al. Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain. J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).
- Xiao, W., et al. Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of α3 integrin-expressing human tumors. EJNMMI research. 6 (1), (2016).
- Li, T. C., et al. Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus. J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).
- Peyret, H. A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants. J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).
- Technologies, N. b. L. . Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).
- Baskin, J. M., et al. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).
