Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química
Summary
Hemos diseñado la proteína de la cápside del virus de la hepatitis E como una nanopartícula de teranosis (HEVNP). HEVNP uno mismo-monta en una jaula icosaédrica estable en la prestación de la mucosa. Aquí, describimos la modificación de HEVNPs para el tumor por mutando residuos superficie expuesta a las cisteínas, que conjugan sintético ligandos que se unen específicamente a las células del tumor.
Abstract
Virus-como partículas (VLPs) se han utilizado como nanocarriers para mostrar epítopos extranjeros y/o entregar pequeñas moléculas en la detección y tratamiento de diversas enfermedades. Esta aplicación se basa en la modificación genética, uno mismo-Asamblea y verbal de la cisteína para cumplir con la aplicación de metas de tumor de VLPs recombinantes en comparación con genética verbal solo, químicos de la modificación de péptidos extraños a VLPs ofrece una significativa ventaja ya que permite una variedad de entidades, tales como péptidos sintéticos u oligosacáridos, al ser conjugado con la superficie de VLPs de forma modular y flexible, sin alteración de la Asamblea VLP.
Aquí, nos muestran cómo utilizar la hepatitis E virus nanopartícula (HEVNP), una cápsula de teranosis modular, como un portador de múltiples funciones de la entrega. Funciones de HEVNPs incluyen metas de tejido, imágenes y entrega terapéutica. Basado en la investigación estructural bien establecida de HEVNP, los residuos estructuralmente independientes y superficie expuesta fueron seleccionados para el reemplazo de cisteína como Conjugación de grupos químicos maleimida vinculado mediante enlaces tiol-selectivo. Una particular cisteína-modificado HEVNP (un reemplazo de Cys de la asparragina en el 573 aa HEVNP – 573C) conjugado con un ligando de célula-específica de cáncer de mama, LXY30 y etiquetados con el infrarrojo cercano (NIR) fluorescencia tinte (Cy5.5), representación dirigida por el tumor HEVNPs como cápsulas diagnóstico eficaces (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Estrategias similares de ingeniería pueden ser empleados con otros complejos macromoleculares con estructuras atómicas conocidas para explorar posibles aplicaciones en la entrega de la teranosis.
Introduction
El desarrollo de vectores de tamaño nanométrico en entrega diagnóstica y terapéutica, conocidas como nanotheranostics, ha cambiado mucho el campo biomédico de tratamientos generalizados hacia entrega específicas1. Entrega de nanotheranostic objetivo integra vectores de tamaño nanométrico (nanopartículas) con moléculas de teranosis para dirigir estable teranosis moléculas específicas del tejido enfermo o vía bioquímica2,3,4 . Nanomedicina ha llegado a la vanguardia de entrega específica porque óptimo tamaño de nanopartículas tienen la capacidad para estabilizar la circulación de las moléculas de la teranosis y atacar selectivamente a moléculas de superficie celular en los tejidos enfermos. Muchas plataformas de nanotheranostic todavía sufren de captación pasiva celular, degradación de prematuro, toxicidad y escasa asociación con moléculas de teranosis. VLPs superan muchos de estos obstáculos en la entrega específica. Se han utilizado como nanocarriers para mostrar epítopos extranjeros y/o entregar moléculas pequeñas: un régimen que puede utilizarse para combatir muchas enfermedades1. Esta aplicación se basa principalmente en la propiedad de uno mismo-Asamblea así como la facilidad de modificaciones genéticas, para cumplir con la aplicación diseñada para lo VLP dado. En comparación con la ingeniería genética, Conjugación química de péptidos extraños a VLP muestra una ventaja significativa ya que permite una gran variedad de entidades, como péptidos u oligosacáridos, al ser conjugado a la superficie de VLPs en un modulado y manera flexible sin alteración de montaje VLP.
HEVNPs, derivados de la proteína de cápside VHE recombinante, 2nd abierto lectura marco (ORF2) no infecciosas, uno mismo-montaje de cápsida de unión a la célula y la entrada. Porque HEV evolucionado para la transmisión de la mucosa, la cápside ensamblada es igualmente estable en condiciones mucosa proteolíticas y ácido5. HEVNPs forma un hueco, T = 1 cápside icosaédrica, compuesto de 60 unidades idénticas6,7 de ORF2, haciéndola muy estable tanto en almacenamiento como en duras condiciones fisiológicas. Falta de elementos genéticos virales, la producción eficiente, de alta producción se logra a través de sistema de expresión de baculovirus en células de los insectos. Debido a su estabilidad proteolítica, HEVNPs uno mismo-montado extraídos y purificados del sobrenadante de células, substancialmente reducir pasos de purificación necesaria. Además, HEVNPs poseen un dominio de superficie saliente expuestas (dominio P) conectado a través de una bisagra flexible a una estable base icosaédrica. El dominio de P forma picos superficie expuesta sobre la base de icosaédrica mientras la bisagra flexible permite modificar de manera significativa el dominio P sin comprometer la base estructura icosaédrica. Con 60 unidades repetidas, sola modificación específica resulta en 60 sitios simétricos para modulación de la química. Recientemente, hemos propuesto una plataforma de nano con HEVNP que puede químicamente conjugado ligandos o moléculas pequeñas para aplicaciones de teranosis. Esto se logró mediante la sustitución de un solo aminoácido con cisteína en el dominio de la saliente de HEV-VLP como un sitio de reacción con ligado de maleimida péptidos o moléculas. Basado en el anterior análisis estructural de HEV-VLP y epítopes inmunogénicos estudiados8,9, los siguientes cinco HEV-VLP aminoácidos fueron reemplazados con cisteína como candidatos potenciales: Y485C, T489C, S533C, N573C y T586C ( Figura 1). Después de la expresión y purificación de células de los insectos, sus formaciones de VLP fueron confirmadas por la observación de la microscopia electrónica (TEM) de transmisión (figura 2), y los sitios de cisteína expuesta se analizaron por Western blot después de biotina maleimida-ligado verbal (figura 2). Entre los cinco mutantes, HEVNP – 573C muestran la señal más fuerte de la conjugación de maleimida-biotina (figura 2) y fue utilizado para seguimiento de demostración como el nanocarrier para la célula de cáncer de mama dirigido a4 (figura 3).
Este protocolo describe métodos de conjugación química para fijar moléculas dirigidas a tumor al HEVNPs a través de la conjugación de cisteína superficial. Detallamos la conjugación de moléculas de orientación y detección de tumor para la entrega de tumor con HEVNPs recombinantes que contiene cisteína en N573 (HEVNP – 573C). Nos enfocamos en un proceso de conjugación química de dos pasos haga clic en enlazar un tumor de cáncer de mama targeting peptide, LXY3010 a HEVNPs de forma LXY30-HEVNP (figura 4). Posteriormente, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 fueron conjugados en el sitio de Lys separado en HEVNPs para construir LXY30-HEVNP-Cy5.5 de detección fluorescente ambos en vitro (figura 5) y en vivo4.
Protocol
Representative Results
Discussion
En contraste con el procedimiento de ingeniería genética desperdiciador de tiempo, que generalmente toma semanas, aquí demostramos dos simple pasos y procedimientos de química verbal un solo paso, que pueden terminar dentro de 3 días, de añadir el cáncer dirigidos a ligando o tinte de detección de fluorescencia a los sitios de Cys/Lys de HEVNPs. La técnica puede ser usada para detectar el mejor destino de ligando de un grupo de candidatos y así se aprovecha de los servicios de síntesis de pequeños péptidos d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el patrocinio de la financiación a RHC por NIH grant #’ s: AI095382, EB021230, CA198880, Instituto Nacional de alimentos y agricultura, así como el programa de profesor distinguido de Finlandia.
Materials
| MINI Dialysis Units, 10K MWCO | Thermo Fisher Scientific | 69572 | mini dialysis unit |
| High Five Cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | Tn5 cells |
| SF9 Cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 cells |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Thermo Fisher Scientific | A11101, A11100 | Baculovirus expression system |
| Bac-to-Bac Baculovirus Expression System | Life Technologies | 10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024 | Bacmid |
| ESF921 Insect Cell Media | Expression Systems LLC | 96-001-01 | insect cell media |
| Cy5.5 NHS ester, 5mg | Lumiprobe Corp | 27020 | Cy5.5 NHS ester |
| Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL | Thermo Scientific | 87766 | spin desalting column |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich Chemical Co | M8250-250G | MES |
| Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes | Beckman Coulter, Inc | Depends on Rotor | ultracentrifuge tube |
| NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NPO321BOX | SDS protein gel |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362100 | transfection reagent |
| EMS Glow Discharger | Electron Microscopy Science | glow discharger |
References
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