Kvantitativ analyse av Neuronal dendrittiske Arborization kompleksitet i Drosophila
Summary
Denne protokollen fokuserer på kvantitativ analyse av neuronal dendrittiske arborization kompleksitet (NDAC) i Drosophila, som kan brukes for studier av dendrittiske morphogenesis.
Abstract
Dendrites er forgrenet anslagene av en Nevron dendrittiske morfologi gjenspeiler synaptic organisasjon under utvikling av nervesystemet. Drosophila larver neuronal dendrittiske arborization (da) er en ideell modell for å studere morphogenesis nevrale dendrites og gen funksjon i utviklingen av nervesystemet. Det er fire klasser av da neurons. Klasse IV er de mest komplekse med en forgrening mønster som dekker nesten hele området av larver kroppen veggen. Vi har tidligere preget effekten av silencing Drosophila ortholog av SOX5 i klasse IV neuronal dendrittiske arborization kompleksitet (NDAC) med fire parameterne: lengden på dendrites, areal dendrite dekning, den Totalt antall grener, og strukturen forgrening. Denne protokollen presenterer arbeidsflyten NDAC kvantitativ analyse larver disseksjon, AC confocal mikroskopi og bildet analyse prosedyrer bruker ImageJ programvare. Videre innsikt i da neuronal utvikling og dens underliggende mekanismer vil øke forståelsen av neuronal funksjon og gi hint om de grunnleggende årsakene til nevrologiske og neurodevelopmental lidelser.
Introduction
Dendrites, som forgrenet anslagene av en Nevron, dekker feltet som omfatter nevrons sensoriske og synaptic innspill fra andre neurons1,2. Dendrites er en viktig komponent av synapse formasjon og spille en avgjørende rolle i integrere synaptic innganger, samt spre elektrokjemiske stimulering i en Nevron. Dendrittiske arborization (da) er en prosess som neurons danne nye dendrittiske trær og grener for å opprette nye synapser. Utvikling og morfologi av da, som grenen tetthet og gruppering mønstre, opprettes flere trinn biologiske prosesser og er sterkt korrelert til nevronale funksjon. Målet med denne protokollen er en metode for kvantitativ analyse av neuronal dendritric arborization kompleksitet i Drosophila.
Kompleksiteten i dendrites bestemmer synaptic typer, tilkobling og innspill fra partner neurons. Forgrening mønstre og tetthet av dendrites er involvert i behandler signalene som sammen på dendrittiske feltet3,4. Dendrites har muligheten for justering i utvikling. For eksempel har synaptic signalering en effekt på dendrite organisasjonen somatosensory Nevron under utviklingsfasen og modne nervesystemet5. Etableringen av neuronal tilkobling avhengig av morphogenesis og modning av dendrites. Misdannelse av dendrites er assosiert med svekket neuronal funksjon. Studier har vist at abnormiteten av da neuron morphogenesis kan bidra til etiologies av flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD), og Lou Gehrig sykdom / Amyotrofisk lateral sklerose (ALS)6,7,8. Synaptiske endringer vises i den tidlige fasen av Annonsen, sammen med nedgang og nedskrivning av Nevron funksjon7,8. Informasjon om hvordan dendrite patologi bidrar til patogenesen i disse nevrodegenerative sykdommer er imidlertid fortsatt flyktig.
Utviklingen av dendrites er regulert av gener som koder et kompleks nettverk av regulatorer, som Wnt familie proteiner9,10, transkripsjonsfaktorer og ligander på cellen overflate reseptorer11,12 . Drosophila da neurons består av fire klasser (Class I, II III, IV), av hvilken klasse IV da neurons har mest komplekse forgrening mønstre og har vært ansatt som en kraftig eksperimentelle system for bedre forståelse morphogenesis13, 14. Under tidlig morphogenesis, overuttrykte og/eller RNAi stanse gener i klasse IV da neurons medføre endringer i forgrening mønstre og dendrite beskjæring13. Det er viktig å utvikle en praktisk metode for kvantitativ analyse av neuronal dendrittiske arborization.
Vi har tidligere vist at stanse Drosophila ortholog av SOX5, Sox102F, førte til kortere dendrites av da neurons og redusert kompleksitet i klasse IV da neurons15. Her presenterer vi prosedyren kvantitativ analyse for neuronal dendrittiske arborization kompleksiteten (NDAC) i Drosophila. Denne protokollen, tilpasset fra tidligere beskrevet metodikken, gir en kort metode for å analysen utviklingen av da sensoriske neurons. Det illustrerer den robuste bildet merking og da Nevron i den tredje skikkelsen larver kroppen veggen16,17,18,19. Det er en verdifull protokoll for forskere som ønsker å undersøke NDAC og utviklingsmessige forskjeller i vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dendrites som innervate overhuden er input områdene av neurons, og deres morphologies bestemmer hvordan informasjon er mottatt og behandlet av individuelle neurons. Utvikling dendrite morfologi gjenspeiler genet modulering av dendrite organisasjon. Drosophila larver da Nevron av perifere nervesystemet er en viktig modell for å studere dendrite utvikling fordi: 1) den funksjonell likheten med pattedyr11,12; 2) fire klasseskille basert på dendrite struk…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke William A. Eimer for bildebehandling kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av kur Alzheimers fondet [R.E.T], National Institute of Health [R01AG014713 og R01MH60009 å R.E.T; R03AR063271 og R15EB019704 til Al], og National Science Foundation [NSF1455613 til Al].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
References
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
- Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
- Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer’s disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
- Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
- Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
- Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
- Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
- Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
- Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
- Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer’s disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
