ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析
Summary
このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) の定量分析、ショウジョウバエ、樹状突起の形態形成の研究に使用することができます。
Abstract
樹状突起、ニューロンは、分岐予測、樹状突起の形態が神経系の開発の間にシナプス組織を反映しています。ショウジョウバエ幼虫の神経樹状パターン形成 (da) は、神経樹状突起、神経系の発達における遺伝子の機能の形態を研究するための理想的なモデルです。Da 細胞の 4 つのクラスがあります。クラス IV は larval ボディ壁のほぼ全領域をカバーする分岐パターンと最も複雑です。クラス IV の神経樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) 4 つのパラメーターを使用してSOX5のショウジョウバエ相同をサイレンシングの効果を特徴付けた以前: 樹状突起の長さ、デンドライト カバレッジの表面積、分岐、および分岐構造の合計数。このプロトコルは NDAC 定量分析、幼生解離、共焦点顕微鏡と ImageJ ソフトウェアを使用して画像解析手順で構成されるワークフローを示します。Da ニューロンの開発とその基になる機構にさらなる洞察力、神経機能の理解を改善し、神経の根本的な原因についての手がかりを提供して神経発達障害。
Introduction
樹状突起、ニューロンの分岐予測であるは、他のニューロン1,2からニューロンの感覚およびシナプス入力を含むフィールドをカバーします。樹枝状結晶はシナプスの形成の重要なコンポーネントおよびニューロンに電気刺激の伝播し同様、シナプスの入力の統合において重要な役割を果たします。樹状分枝 (da) は、新しいシナプスを作成する新しい樹状分枝ニューロンを形成するプロセスです。Da 支店密度などグループ化パターンの形態と開発多段階の生物学的プロセスの結果、神経機能に相関の高い。このプロトコルの目的はの神経 dendritric 楔形の複雑さの定量分析のためのメソッドを提供するショウジョウバエ。
樹状突起の複雑さは、シナプスの種類、接続、およびパートナーのニューロンからの入力を決定します。分岐パターンおよび樹枝状結晶の密度は樹状フィールド3,4上に収束する信号処理に関与しています。樹状突起は、開発調整の柔軟性を持っています。例えば、シナプス合図では、体性感覚ニューロン発達段階と成熟した神経系5のデンドライト組織に影響を及ぼす。神経接続の確立は、形態形成と樹状突起の成熟に依存します。樹状突起の奇形は神経機能障害に関連付けられます。研究は、da ニューロンの形態形成の異常がアルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD)、ハンチントン病 (HD) を含む複数の神経変性疾患、ルー ・ ゲーリック病の病因に貢献することを示されている/筋萎縮性側索硬化症 (ALS)6,7,8。シナプス変化は衰退とニューロン機能7,8の減損とのコンサートで、広告の初期の段階で表示されます。ただし、デンドライト病理学がこれらの神経変性疾患の病因に貢献する方法の具体的な内容は、とらえどころのないままです。
規制当局、タンパク質9,10、転写因子、細胞表面の受容器11,12 配位子の Wnt ファミリーなどの複雑なネットワークをエンコードする遺伝子によって樹状突起の発達の制御します。.ショウジョウバエda ニューロンから成る 4 つのクラス (クラス I、II III、IV)、クラス IV の da ニューロンは最も複雑な分岐パターンを持っているし、より良い理解形態13、強力な実験的システムとして採用されています。 14。初期形態形成における過剰発現や RNAi はクラス IV の da ニューロンの遺伝子のサイレンシングは分岐パターンとデンドライト剪定13の変化の結果します。神経細胞の樹状突起パターン形成の定量分析のための実用的な方法を開発することが重要です。
我々 は以前にSOX5のショウジョウバエ相同を黙らせる、 Sox102F、導いた短い樹状突起の da ニューロンとクラス IV da ニューロン15の複雑さを軽減します。ショウジョウバエにおける神経樹状パターン形成の複雑さ (NDAC) の定量分析の手順を紹介します。このプロトコルは、以前説明した方法論からの適応は、da ニューロンの開発を試金する簡潔な方法を提供します。ロバストな画像のラベル付け、3 齢幼虫の体壁16,17,18,19の da ニューロンを示しています。NDAC と体内の発達の違いを調査したい人のための貴重なプロトコルです。
Protocol
Representative Results
Discussion
表皮を刺激する樹状突起、ニューロンの入力領域とどのように情報の受信を検出し、個々 のニューロンによって処理の形態を決定します。開発デンドライト形態は、デンドライト組織の遺伝子の調節を反映しています。末梢神経系のショウジョウバエ幼虫の da ニューロンは樹状突起の形成のための研究のための重要なモデル: 1) 哺乳類11,12; …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はイメージングの技術援助のためウィリアム A. Eimer を感謝したいです。この作品は 【 R.E.T] を治療アルツハイマー病の資金によって支えられた、国立衛生研究所の 【 R01AG014713 ・ R.E.T; に R01MH60009R03AR063271、アダムローリーに R15EB019704] 国立科学財団 [アダムローリーに NSF1455613]。
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
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