Kwantitatieve analyse van neuronale dendritische Arborization complexiteit in Drosophila
Summary
Dit protocol is gericht op kwantitatieve analyse van complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila, die kan worden gebruikt voor studies van dendritische morfogenese.
Abstract
Dendrites de vertakte projecties van een neuron worden en dendritische morfologie weerspiegelt synaptic organisatie tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Drosophila larvale neuronale dendritische arborization (da) is een ideaal model voor het bestuderen van de morfogenese van neurale dendrites en genfunctie in de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Er zijn vier klassen van da neuronen. Klasse IV is het meest complex met een vertakkende patroon dat betrekking heeft op bijna het hele gebied van de larvale lichaam muur. Wij hebben eerder het effect van het monddood maken van de ortholog van de Drosophila van SOX5 op klasse IV neuronale dendritische arborization complexiteit (NDAC) met behulp van vier parameters gekenmerkt: de lengte van dendrites, de oppervlakte van de dendriet dekking, de totaal aantal van takken, en de vertakkende structuur. Dit protocol stelt de workflow van NDAC kwantitatieve analyse, bestaande uit de larvale dissectie, confocal microscopie en afbeelding analysemethodes ImageJ softwarematig. Verder inzicht in da neuronale ontwikkeling en de onderliggende mechanismen zal verbetering van het inzicht van neuronale functie en aanwijzingen over de fundamentele oorzaken van neurologische en neurologische aandoeningen.
Introduction
Dendrites, die de vertakte projecties van een neuron, betrekking hebben op het veld dat van het neuron zintuiglijke en synaptische ingangen van andere neuronen1,2 omvat. Dendrites zijn een belangrijk onderdeel van synapse formation en spelen een cruciale rol in de integratie van synaptic ingangen, evenals de elektrochemische stimulatie in een neuron teeltmateriaal. Dendritische arborization (da) is een proces waarmee vormen de neuronen nieuwe dendritische bomen en takken maken nieuwe synapsen. De ontwikkeling en de morfologie van de da, zoals tak dichtheid en groepering patronen, resultaat van scriptingregel biologische processen en zijn sterk gecorreleerd aan neuronale functie. Het doel van dit protocol is bedoeld als een methode voor kwantitatieve analyse van neuronale dendritric arborization complexiteit in Drosophila.
De complexiteit van dendrites bepaalt de synaptische typen, connectiviteit en ingangen van partner neuronen. Vertakkende patronen en een bevolkingsdichtheid van dendrites betrokken zijn bij de verwerking van de signalen die naar de dendritische veld3,4 convergeren. Dendrites hebben de flexibiliteit om aanpassing in ontwikkeling. Bijvoorbeeld heeft synaptic signaling een effect op dendriet organisatie in de somatosensorische neuron tijdens de ontwikkelings fase en het volwassen zenuwstelsel5. De oprichting van neuronal connectiviteit is afhankelijk van de voedselproductie en de rijping van dendrites. Misvorming van dendrites wordt geassocieerd met verminderde neuronale functie. Studies hebben aangetoond dat de abnormaliteit van da neuron morfogenese aan de etiologie van meerdere neurodegeneratieve ziekten bijdragen kan, met inbegrip van de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), en Lou Gehrig’s disease / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)6,7,8. Synaptic wijzigingen weergegeven in het beginstadium van AD, in overleg met de achteruitgang en de bijzondere waardevermindering van neuron functie7,8. Echter, de specifieke kenmerken van hoe dendriet pathologie bijdraagt aan pathogenese in deze neurodegeneratieve ziekten blijft ongrijpbaar.
De ontwikkeling van dendrites wordt gereguleerd door de genen die coderen voor een complex netwerk van regelgevende instanties, zoals de familie van de Wnt van eiwitten9,10, transcriptiefactoren en liganden op cel oppervlakte receptoren11,12 . Drosophila da neuronen bestaan uit vier klassen (klasse I, II, III, IV), van welke klasse IV da neuronen hebben de meest complexe vertakkende patronen en hebben gewerkt als een krachtige experimenteel systeem voor beter begrip morfogenese13, 14. Tijdens de vroege morfogenese, overexpressie en/of RNAi zwijgen van genen in klasse IV da neuronen leiden tot veranderingen in de vertakkende patronen en dendriet snoeien13. Het is belangrijk een praktische methode voor de kwantitatieve analyse van de neuronale dendritische arborization te ontwikkelen.
Wij hebben eerder aangetoond dat zwijgen van de Drosophila ortholog van SOX5, Sox102F, tot kortere dendrites van da neuronen en verminderde complexiteit in klasse IV da neuronen15 leidde. Hier presenteren we de procedure voor kwantitatieve analyse voor de complexiteit van de neuronale dendritische arborization (NDAC) in Drosophila. Dit protocol, aangepast uit de vorige beschreven methodologie, biedt een korte methode om de ontwikkeling van de sensorische neuronen da assay. Het illustreert de robuuste afbeelding labeling en de da neuron in de derde instar larvale lichaam muur16,17,18,19. Het is een waardevolle protocol voor onderzoekers die willen onderzoeken van de NDAC en ontwikkelingsstoornissen verschillen in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dendrites die de epidermis innervate zijn de input gebieden van neuronen en hun morphologies bepalen hoe de informatie is ontvangen en verwerkt door individuele neuronen. Ontwikkeling dendriet morfologie weerspiegelt gene modulatie van dendriet organisatie. De Drosophila larvale da neuron van het perifere zenuwstelsel is een belangrijk model voor het bestuderen van dendriet ontwikkeling omdat: 1) de functionele gelijkenis met zoogdieren11,12; 2) vier kla…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedank William A. Eimer voor imaging technische bijstand. Dit werk werd gesteund door de Cure Alzheimer Fonds [R.E.T], het National Institute of Health [R01AG014713 en R01MH60009 voor de R.E.T; R03AR063271 en R15EB019704 naar A.L.], en de National Science Foundation [NSF1455613 naar A.L.].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
References
- Wassle, H., Boycott, B. B. Functional architecture of the mammalian retina. Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).
- MacNeil, M. A., Masland, R. H. Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).
- Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons. Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).
- Jaworski, J., et al. Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity. Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).
- Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases. BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).
- Baloyannis, S. J. Dendritic pathology in Alzheimer’s disease. J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).
- Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).
- Wayman, G. A., et al. Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2. Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).
- Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development. Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons. Cell. 112 (6), 805-818 (2003).
- Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt. Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Sears, J. C., Broihier, H. T. FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons. Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment. Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).
- Misra, M., et al. A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis. G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).
- Emoto, K., et al. Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons. Cell. 119 (2), 245-256 (2004).
- Olesnicky, E. C., et al. Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis. G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
- Crozatier, M., Vincent, A. Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier. Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).
- Copf, T. Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development. Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).
- Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).
- Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. Full reversal of Alzheimer’s disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3. J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).
- Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
