초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석
Summary
이 프로토콜에서 초파리, 수지상 morphogenesis의 연구를 위해 사용 될 수 있는 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)의 정량 분석에 집중 한다.
Abstract
모 수석 신경의 분기 예측 이며 수지상 형태학 반영 시 냅 스 조직 신경 시스템의 개발. 초파리 애벌레 신경 돌기 arborization (다) 공부 morphogenesis dendrites 신경 및 신경 시스템의 개발에 유전자 기능에 대 한 이상적인 모델입니다. Da 뉴런의 4 개의 클래스가 있습니다. 클래스 IV는 거의 전체 면적 애벌레 몸 벽의 분기 패턴으로 가장 복잡 한입니다. 우리는 이전 클래스 IV 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC) 4 개의 매개 변수를 사용 하 여 SOX5 의 초파리 ortholog 침묵의 효과 특징: dendrites의 길이, 모 수석 검사의 표면적은 지점과 분기 구조의 총 수입니다. 이 프로토콜의 NDAC 정량 분석, 애벌레 해 부, confocal 현미경 검사 법 및 이미지 분석 절차 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 구성 된 워크플로 제공 합니다. 다 신경 개발 및 그것의 근본적인 메커니즘에 더 통찰력 신경 기능에 대 한 이해를 개선 하 고 신경의 근본적인 원인에 대 한 단서를 제공 및 neurodevelopmental 장애.
Introduction
모 수석 신경의 분기 예상치는 다른 뉴런1,2에서 신경의 감각 및 시 냅 시스 입력을 포함 하는 필드를 커버. Dendrites 시 냅 스 형성의 중요 한 요소 이며, 시 냅 시스 입력의 통합 신경에 전기 자극을 전파에 중요 한 역할. 수지상 arborization (다)는 신경 형성 새로운 수지상 나무와 가지를 새로운 시 냅 스를 만드는 과정 이다. 개발 및 다 지점 밀도 및 그룹화 패턴 등의 형태 다단계 생물학 과정에서 발생 하 고 매우 신경 기능에 상관. 이 프로토콜의 목표 arborization 복잡 한 신경 dendritric의 정량 분석에 대 한 메서드를 제공 하는 초파리.
모 수석의 복잡 시 냅 스 종류, 연결 및 파트너 뉴런에서 입력을 결정합니다. 분기 패턴 및 모 수석의 밀도 수지상 필드3,4에 수렴 하는 신호 처리에서 포함 된다. 모 수석 개발 조정에 대 한 유연성 있습니다. 예를 들어, 발달 단계 somatosensory 신경 및 성숙한 신 경계5모 수석 조직에 영향이 있다 시 냅 스 신호. 신경 연결의 설립 morphogenesis 및 모 수석의 성숙에 의존합니다. 모 수석의 기형 장애 신경 기능으로 연결 됩니다. 연구 다 신경 morphogenesis의 이상은 여러 신경 퇴행 성 질병, Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 게 릭 병의 etiologies에 기여할 수 있습니다 / 루 경화 증 (ALS)6,,78. 시 냅 스 변경 감소와 장애 신경 기능7,8의 콘서트에서 광고의 초기 단계에 나타납니다. 그러나, 모 수석 병리학이 신경 퇴행 성 질환 병 인에 기여 하는 방법의 구체적인 애매 남아 있습니다.
모 수석의 개발은 레 귤 레이 터, 단백질9,10, 녹음 방송 요인과 세포 표면 수용 체11,12에 ligands의 Wnt 제품군 등의 복잡 한 네트워크 부호화 하는 유전자에 의해 규제 . 4 클래스 (클래스 I, II III, IV), 클래스 4의 다 신경 가장 복잡 한 분기 패턴을가지고 더 나은 이해 morphogenesis13, 강력한 실험 시스템으로 고용 되어 이루어져 초파리 다 신경 14. 초기 morphogenesis 동안 overexpression 및 RNAi 클래스 IV 다 신경 세포에서 유전자의 입을 분기 패턴 및 모 수석 정리13변경 될. 그것은 신경 돌기 arborization의 정량 분석을 위한 실용적인 방법을 개발 해야 합니다.
우리는 이전을 SOX5의 초파리 ortholog의 입을, Sox102F, 주도 다 신경 및 클래스 IV 다 신경15에서 감소 된 복잡성의 짧은 dendrites 나타났습니다. 여기, 우리는 초파리에서 신경 돌기 arborization 복잡도 (NDAC)에 대 한 정량 분석의 절차를 제시. 이전 설명한 방법론에서 적응이 프로토콜 다 감각 신경의 개발 시험 하는 간단한 방법을 제공 합니다. 그것은 강력한 이미지 라벨 및 세 번째 탈피 애벌레 몸 벽16,17,,1819에 다 신경 보여 줍니다. 그것은 NDAC 및 발달 차이 vivo에서조사 하고자 하는 연구자에 대 한 귀중 한 프로토콜입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dendrites 표 피를 자극 하는 뉴런의 입력된 영역 하 고 그들의 형태학 정보 접수 및 개별 뉴런에 의해 처리 방법을 결정 합니다. 개발 모 수석 형태 모 수석 조직의 유전자 변조를 반영합니다. 초파리 애벌레 다 신경의 말 초 신 경계는 모 수석 개발 때문에 공부에 대 한 중요 한 모델: 1) 포유류11,12; 기능적 유사성 모 수석 구조11…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 윌리엄 A. Eimer 이미징 기술 지원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품 [하 R.E.T], 치료 질병의 기금에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 건강 [R01AG014713 및 R01MH60009 R.E.T;에 R03AR063271 및 R15EB019704 앨 러 배 마에], 그리고 국립 과학 재단 [앨 러 배 마에 NSF1455613].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
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