Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila
Summary
Este protocolo se centra en el análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila, que puede ser utilizado para estudios de morfogénesis dendríticas.
Abstract
Las dendritas son las proyecciones ramificadas de la neurona, y morfología dendrítica refleja organización sináptica durante el desarrollo del sistema nervioso. Arborización dendrítica neuronal (da) de larvas de Drosophila es un modelo ideal para el estudio de morfogénesis de las dendritas neuronales y funciones de los genes en el desarrollo del sistema nervioso. Hay cuatro clases de neuronas da. Clase IV es el más complejo con un patrón de ramificación que cubre casi toda la zona de la pared del cuerpo larval. Anteriormente hemos caracterizado el efecto de silenciar el ortólogo de Drosophila de SOX5 en clase de complejidad de la arborización dendrítica neuronal del IV (NDAC) utilizando cuatro parámetros: la longitud de las dendritas, la superficie de la cobertura de la dendrita, el número total de ramas y la estructura de ramificación. Este protocolo presenta el flujo de trabajo de análisis cuantitativo NDAC, consisten en larvas disección, microscopia confocal y procedimientos de análisis de imagen usando el software ImageJ. Más penetración en el desarrollo neuronal de da y sus mecanismos subyacentes mejorará la comprensión de la función neuronal y proporcionar pistas sobre las causas fundamentales de neurológico y trastornos del neurodesarrollo.
Introduction
Las dendritas, que son las proyecciones ramificadas de la neurona, cubren el campo que abarca entradas sensoriales y sinápticas de la neurona de otras neuronas1,2. Las dendritas son un componente importante de la formación de sinapsis y juegan un papel crítico en la integración de entradas sinápticas, así como propagar el estímulo electroquímico en una neurona. Arborización dendrítica (da) es un proceso por el cual las neuronas forman nuevos árboles dendríticos y ramas para crear nuevas sinapsis. El desarrollo y la morfología de la da, como rama densidad y patrones de agrupación, resultan de procesos biológicos de múltiples pasos y están altamente correlacionados con la función neuronal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método para el análisis cuantitativo de la complejidad de arborización neuronal dendritric en Drosophila.
La complejidad de las dendritas determina los tipos sinápticos, conectividad y entradas de las neuronas de la pareja. Patrones de ramificación y la densidad de las dendritas están involucrados en el procesamiento de las señales que convergen en el campo dendrítico3,4. Las dendritas tienen la flexibilidad para el ajuste en el desarrollo. Por ejemplo, señalización sináptica tiene un efecto en la organización de la dendrita en las neuronas somatosensoriales durante la fase de desarrollo y en el sistema nervioso maduro5. El establecimiento de la conectividad neuronal se basa en la morfogénesis y maduración de las dendritas. Malformación de las dendritas se asocia con deterioro de la función neuronal. Los estudios han demostrado que la anormalidad de la morfogénesis de la neurona da podría contribuir a las etiologías múltiples enfermedades neurodegenerative, incluyendo enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), y enfermedad de Lou Gehrig / Esclerosis lateral amiotrófica (ELA)6,7,8. Alteraciones sinápticas aparecen en la etapa temprana de la EA, en concierto con la decadencia y la debilitación de la neurona función7,8. Sin embargo, los detalles de cómo patología dendrita contribuye a la patogénesis de estas enfermedades neurodegenerativas sigue siendo elusiva.
El desarrollo de las dendritas está regulado por los genes que codifican una compleja red de reguladores, como la familia Wnt de proteínas9,10, factores de transcripción y ligandos de receptores de superficie celular11,12 . Drosophila da las neuronas consisten en cuatro clases (clase I, II III, IV), de que clase IV da neuronas tienen los patrones de ramificación más complejos y han sido utilizadas como un potente sistema experimental para la mejor comprensión morfogénesis13, 14. Durante la morfogénesis temprana, sobreexpresión o ARNi silenciamiento de genes en neuronas de clase IV da como resultado cambios en los patrones de ramificación y poda de dendrita13. Es importante desarrollar un método práctico para el análisis cuantitativo de la arborización dendrítica neuronal.
Previamente hemos demostrado que silenciar el ortólogo de Drosophila de SOX5, Sox102F, condujo a más cortas dendritas de las neuronas de da y menor complejidad en clase IV da neuronas15. Aquí, presentamos el procedimiento de análisis cuantitativo para la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila. Este protocolo, adaptado de la metodología anterior descrita, proporciona un método breve para analizar el desarrollo de las neuronas sensoriales da. Ilustra la imagen robusta de etiquetado y de las neuronas da en el tercer estadio larval de cuerpo de pared16,17,18,19. Es un protocolo de valioso para los investigadores que deseen investigar la NDAC y diferencias del desarrollo en vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las dendritas que inervan la epidermis son las regiones de entrada de las neuronas y sus morfologías determinan cómo la información es recibida y procesada por neuronas individuales. Morfología de dendrita de desarrollo refleja la modulación genética de la organización de la dendrita. La Drosophila larvas da neurona del sistema nervioso periférico es un importante modelo para el estudio de desarrollo de la dendrita debido: 1) la similitud funcional con mamíferos11,<sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a William A. Eimer por proyección de imagen de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por fondo el cura de Alzheimer [R.E.T], el Instituto Nacional de salud [R01AG014713 y R01MH60009 en la R.E.T; R03AR063271 y R15EB019704 a A.L. y la Fundación Nacional de ciencia [NSF1455613 a A.L.].
Materials
| Phosphate buffered saline(PBS) | Gibco Life Sciences | 10010-023 | |
| TritonX-100 | Fisher Scientific | 9002-93-1 | |
| Paraformaldehyde(PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent | Dow Corning Corportation | 3097366-0516;3097358-1004 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fingernail polish | CVS | 72180 | |
| Stereo microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Confocal microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | |
| Petri dish | Falcon | 353001 | |
| Forceps | Dumont | 11255-20 | |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5611 | |
| Insect Pins | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6082-25 | |
| Microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | 15-188-52 |
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