Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Summary

Hier presenteren we twee protocollen voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} toestroom in geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. Voor geïsoleerde mitochondriën, detailleren wij een plaat lezer gebaseerde Ca^{2 +} import assay met behulp van de Ca^{2 +} gevoelige kleurstof calcium groen-5N. Voor gekweekte cellen beschrijven we een methode van de confocal microscopie met behulp van de Ca^{2 +} kleurstof Rhod-2/AM.

Abstract

CA^{2 +} verwerking door mitochondriën is een kritische functie regulering van de zowel de fysiologische en pathofysiologische processen in een breed spectrum van cellen. De mogelijkheid om de toestroom en efflux van Ca^{2 +} uit mitochondriën nauwkeurig te meten is belangrijk voor het bepalen van de rol van mitochondriale Ca^{2 +} behandeling in deze processen. In dit rapport presenteren we twee methoden voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} behandeling in zowel geïsoleerde mitochondriën en gekweekte cellen. We detail eerst een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} opname met behulp van de Ca^{2 +} gevoelige kleurstof calcium groen-5N. De plaat lezer gebaseerde indeling omzeilt de behoefte aan gespecialiseerde apparatuur, en de calcium groen-5N kleurstof is bij uitstek geschikt voor het meten van Ca^{2 +} uit geïsoleerde weefsel mitochondriën. Voor onze toepassing beschrijven we de meting van mitochondriale Ca^{2 +} opname in mitochondriën geïsoleerd van muis hartweefsel; deze procedure kan echter worden toegepast voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} opname in mitochondriën geïsoleerd van andere weefsels zoals lever, skeletspieren en de hersenen. Ten tweede, beschrijven we een confocal microscopie gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca^{2 +} in permeabel cellen met behulp van de Ca^{2 +} gevoelige kleurstof Rhod-2/AM en beeldvorming met behulp van 2-dimensionale laser-scanning microscopie. Dit protocol permeabilization elimineert cytosolische kleurstof besmetting, rekening houdend met de specifieke opname van wijzigingen in mitochondriale Ca^{2 +}. Bovendien voorziet laser scanning microscopie in hoge framesnelheid te vangen van snelle veranderingen in de mitochondriale Ca^{2 +} in reactie op de verschillende drugs of reagentia toegepast in de externe oplossing. Dit protocol kan worden toegepast voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} opname in veel celtypen, met inbegrip van primaire cellen zoals cardiale myocytes neuronen en vereeuwigd cellijnen.

Introduction

Mitochondriën zijn kritieke sites van intracellulaire Ca^{2 +} opslag en signalering. Decennia van onderzoek hebben aangetoond dat mitochondriën hebben de mogelijkheid om te importeren en sekwestreren Ca^{2 + 1,2}. Mitochondriën, zijn echter niet louter passieve sites van Ca^{2 +} opslag. CA^{2 +} bij de mitochondriale compartiment functies fundamentele signalering met inbegrip van de verordening van metabole output en activering van mitochondriale-gemedieerde cel dood trajecten, die al herzien eerder³. Voor de verordening van het metabole verbetert Ca^{2 +} de activiteit van drie matrix-gelokaliseerde dehydrogenases van de tricarboxylic acid cyclus evenals respiratoire ketencomplexen, te verhogen van mitochondriale energie productie^4,5 . Met mitochondriale Ca^{2 +} overbelasting en dysregulated mitochondriale Ca^{2 +} handling, Ca^{2 +} triggers mitochondriale permeabiliteit overgang porie (MPTP) openen, wat leidt tot mitochondriale binnenste membraan-permeabilization, membraan potentiële verlies, mitochondriale dysfunctie, zwelling, scheuren en uiteindelijk, cel dood^6,7,8,9. Dus, mitochondriale Ca^{2 +} signalering direct invloed zowel cellulaire leven en dood paden door metabole controle- en MPTP-dood as.

In de afgelopen jaren, er heeft zijn snel groeiende belangstelling voor de studie van mitochondriale Ca^{2 +} dynamiek gepast in groot deel aan de identificatie van de moleculaire bestanddelen van de mitochondriale Ca^{2 +} uniporter complex, een mitochondriale inner membraan-vervoerder die is een primaire modus van Ca^{2 +} importeren in de mitochondriale matrix ^10,11,12. Identificatie van deze structureel en regelgevend subeenheden van de uniporter heeft de mogelijkheid van genetisch targeting mitochondriale Ca^{2 +} toestroom te moduleren mitochondriale functie en dysfunctie voortgebracht en vergemakkelijkt de studie van de bijdrage van de uniporter complexe en mitochondriale Ca^{2 +} toestroom aan ziekte^13,14,15. Inderdaad, de mitochondriale Ca^{2 +} signalering heeft zijn betrokken bij de pathologieën van een divers scala aan ziekten, variërend van cardiale ziekte neurodegeneratie, en kanker^{16,17,18, 19,20}.

Gezien het fundamentele belang van mitochondriale Ca^{2 +} signalering in metabolisme en dood van de cel, en gecombineerd met het brede bereik van biologische systemen dat mitochondriale Ca^{2 +} signalering gevolgen, methoden voor het beoordelen van de mitochondriale Ca^{2 +} instroom zijn van groot belang. Niet verrassend, een verscheidenheid aan technieken en hulpmiddelen voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} zijn ontwikkeld. Deze omvatten methoden die gebruik maken van hulpmiddelen zoals fluorescerende Ca^{2 +}-gevoelige kleurstoffen^21,22 en^{genetisch-gecodeerde Ca 2 +} sensoren gericht op de mitochondriën, zoals cameleon en aequorin^{23, 24}. Het doel van dit artikel is om te markeren van de verschillende methoden en modelsystemen waarin mitochondriale Ca^{2 +} opname kan worden gemeten. Presenteren we twee experimentele methoden voor de beoordeling van de mitochondriale Ca^{2 +} toestroom capaciteit. Cardiale mitochondriën als een voorbeeld gebruikt, we detail een plaat lezer-gebaseerd platform voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} opname met behulp van de Ca^{2 +} gevoelige kleurstof calcium groen-5N die ideaal geschikt is voor geïsoleerde weefsel mitochondria¹⁴ . Met behulp van gekweekte NIH 3T3 cellen, beschrijven we ook een confocale microscopie imaging gebaseerde assay voor meting van mitochondriale Ca^{2 +} in permeabel cellen met behulp van de Ca^{2 +} gevoelige kleurstof Rhod-2/AM²⁵.

Protocol

Alle methoden die worden beschreven in dit protocol zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Emory University. Opmerking: Het eerste deel is de experimentele procedure voor het meten van mitochondriale Ca2 + toestroom in geïsoleerde cardiale mitochondriën met behulp van een afleesapparaat. 1. reagentia en oplossingen Breng 500 mL MS-EGTA buffer voor mitochondriale isolatie: 225 mM mannitol, sacharose 75 mM, 5 …

Representative Results

Figuur 1 toont mitochondriale Ca2 + opname metingen in geïsoleerde cardiale mitochondriën met behulp van de plaat lezer gebaseerde platform en de Ca2 + kleurstof calcium groen-5N. Onder controlevoorwaarden (figuur 1A), cardiale mitochondriën werden opgeschort in KCl buffer met calcium groen-5N en vervolgens uitgedaagd met opeenvolgende pulsen van CaCl2 (5 μl van een 0.6 mM CaCl2 opl…

Discussion

Hier beschrijven we twee verschillende benaderingen voor het meten van mitochondriale Ca^{2 +} toestroom. De plaat lezer gebaseerde calcium groen-5N methode monitoren extramitochondrial Ca^{2 +} niveaus en is een Ca^{2 +} opname test die is uitermate geschikt voor metingen in geïsoleerde mitochondriën. Terwijl wij representatieve resultaten uit geïsoleerde lymfkliertest cardiale mitochondriën hebben aangetoond, is deze test kunnen gemakkelijk aangepast voor mitochondria geïsoleerd uit weefsel…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440