고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Summary

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca^{2 +} 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca^{2 +} 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca^{2 +} 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

Abstract

캘리포니아^{2 +} 미토 콘 드리 아에 의해 처리 광범위 한 셀에서에서 생리 및 병 태 생리 과정을 조절 하는 중요 한 기능 이다. 정확 하 게 유입 및 캘리포니아^{2 +} 미토 콘 드리 아에서의 경과 측정 하는 능력은 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 이러한 프로세스에 처리의 역할을 결정 하기 위한 중요 합니다. 이 보고서에서 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아와 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 처리의 측정을 위한 두 가지 방법을 제시. 우리는 먼저 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관은 Ca^{2 +} 민감한 염료 칼슘 그린-5N을 사용 하 여 측정 하기 위한 플레이트 리더 기반 플랫폼을 선발. 플레이트 리더 기반 형식 circumvents 특수 장비에 대 한 필요 그리고 칼슘 그린-5N 염료 측정 캘리포니아^{2 +} 절연된 조직 미토 콘 드리 아에서 적합. 우리의 응용 프로그램에 대 한 설명 통풍 관 Ca 미토 콘 드 리아^{2 +} 마우스 심 혼 직물;에서 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정 그러나,이 절차 간, 골격 근육, 뇌 등 다른 조직에서 격리 하는 미토 콘 드리 아에서 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 이해 측정에 적용할 수 있습니다. 둘째, 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아의^{2 +} permeabilized 셀 Ca^{2 +} 민감한 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 2 차원 레이저 스캔 현미경을 사용 하 여 이미징 측정 confocal 현미경 기반 분석 결과 설명 합니다. 이 permeabilization 프로토콜 cytosolic 염료 오염, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +}에서 변화의 특정 기록에 대 한 허용을 제거 합니다. 또한, 레이저 스캔 현미경 높은 프레임 속도를 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 다양 한 약물 이나 외부 솔루션에서 적용 시 약에 대 한 응답에서의 빠른 변화를 캡처 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 심장 myocytes 및 신경, 불멸 하 게 셀 선 등 1 차 셀을 포함 하 여 많은 세포 유형에 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 글귀를 측정에 적용할 수 있습니다.

Introduction

미토 콘 드리 아의 세포내 캘리포니아^{2 +} 저장과 신호 중요 한 사이트입니다. 연구의 십 년간은 미토 콘 드리 아를 가져오고 캘리포니아^{2 + 1,2}격리 능력을가지고 설명 했다. 그러나 미토 콘 드리 아,, 단지 수동 사이트의 캘리포니아^{2 +} 저장 되지 않습니다. 미토 콘 드 리아 구획에서 캘리포니아^{2 +} 대사 출력의 규칙을 포함 하 여 기본적인 신호 기능을 수행 하 고 있다 중재 미토 콘 드리 아 세포 죽음 통로의 활성화 검토 이전³. 신진 대사 조절에 대 한 캘리포니아^{2 +} 의 활동을 강화 3 매트릭스 지역화 dehydrogenases tricarboxylic 산 주기 뿐만 아니라 호흡 사슬 복합물, 미토 콘 드 리아 에너지 생산^{4,5 증가} . 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 과부하 및 dysregulated 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 처리, 캘리포니아^{2 +} 트리거 미토 콘 드 리아 침투성 전환 기 미토 콘 드리 아 내 막 permeabilization, 선도 (MPTP) 오프닝 공 막 잠재적인 손실, 미토 콘 드 리아 기능 장애, 부 종, 파열 하 고 궁극적으로, 죽음^6,7,,89셀. 따라서, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 신호 직접 영향을 미칩니다 셀룰러 삶과 죽음 통로 통해 대사 제어 및 MPTP 죽음 축.

최근 몇 년 동안, 거기는 급속 하 게 확장에 따른 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 역학의 연구에 관심 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} uniporter 복잡 한의 분자 성분의 식별에 큰 부분, 미토 콘 드리 아 내 캘리포니아^{2 +} 의 기본 모드는 막 운송업 자 미토 콘 드 리아 매트릭스 ^10,,1112로 가져옵니다. 이러한 구조 및 규제 소 단위는 uniporter의의 앞뒤로 유전자 타겟팅 미토 콘 드리 아 기능 및 역 기능 변조를 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입의 가능성을 가져 신분증과의 연구를 촉진 합니다 uniporter 복잡 하 고 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 유입 질병^13,,1415의 기여 금. 실제로, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 신호는에 연루 되어 neurodegeneration, 그리고 암^{16,,1718, 심장 질환에서 배열 하는 질병의 다양 한 배열의 병 리 19,20}.

미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 신호 물질 대사와 세포 죽음의 근본적인 중요성을 감안할 때 및 생물 학적 시스템의 광범위 한 도달 범위와 함께 해당 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 신호 영향, 미토 콘 드 리아 Ca^{2 + 평가 하는 방법} 큰 관심의 유입은. 아니나 다를까, 다양 한 기술 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 측정 도구 개발 되었습니다. 이러한 형광 캘리포니아^{2 +}같은 도구를 사용 하는 메서드가 포함-민감한 염료^21,22 및 유전자 인코딩 캘리포니아^{2 +} 센서 미토 콘 드리 아, cameleon 및 aequorin^{23, 등을 대상으로 24}. 이 기사의 목적은 다른 방법 및 미토 콘 드리 아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관 측정 될 수 있는 모델 시스템을 강조 하는. 우리는 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입 용량을 평가 하기 위해 두 가지 실험 방법을 제시. 예를 들어 심장 미토 콘 드리 아를 사용 하 여, 우리 플레이트 리더 기반 플랫폼 세부 측정 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 통풍 관을 사용 하 여 Ca^{2 +} 민감한 염색 칼슘 그린-5N 절연된 조직 미토 콘 드리 아^{14에 적합} . 경작된 한 NIH 3T3 세포를 사용 하 여, 우리 또한 confocal 현미경 이미징 기반 분석 결과 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 캘리포니아^{2 +} 민감한 염료 로드-2/오전²⁵를 사용 하 여 permeabilized 셀에서의 측정에 대 한 설명.

Protocol

이 프로토콜에서 설명 하는 모든 방법 기관 동물 관리 및 사용 위원회의에 모리 대학에 의해 승인 되었습니다가지고. 참고: 첫 번째 부분은 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 유입 플레이트 리더를 사용 하 여 격리 된 심장 미토 콘 드리 아에서 측정 하기 위한 실험 절차 이다. 1. 시 약 및 솔루션 미토 콘 드 리아 격리에 대 한 MS EGTA 버퍼의 500 mL…

Representative Results

그림 1 에서는 미토 콘 드리 아 캘리포니아2 + 통풍 관 측정 플레이트 리더 기반 플랫폼을 사용 하 여 격리 된 심장 미토 콘 드리 아 그리고 캘리포니아2 + 염색 칼슘 그린-5N. 조건 제어 (그림 1A), 심장 미토 콘 드리 아 칼슘 그린-5N 포함 된 KCl 버퍼에 중단 되었고 30에 추가 하는 CaCl2 (0.6 m m CaCl2 솔루…

Discussion

여기, 미토 콘 드 리아 캘리포니아^{2 +} 유입 측정 하 두 가지 다른 방법을 설명 합니다. 플레이트 리더 기반 칼슘 그린-5N 방법 모니터 extramitochondrial Ca^{2 +} 레벨 이며는 Ca^{2 +} 이해 분석 결과 고립 된 미토 콘 드리 아에서의 측정에 적합 하다. 우리가 고립 된 murine 심장 미토 콘 드리 아에서 대표적인 결과 표시는,이 분석 결과 높은 미토 콘 드 리아 풍부한 간, 골격 근육 및 두뇌를 …

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440