Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Summary

Aqui, apresentamos dois protocolos para a medição de mitocondrial Ca^{2 +} afluxo em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Por mitocôndrias isoladas, detalhamos uma placa baseada no leitor Ca^{2 +} importação ensaio usando o Ca^{2 +} sensível tingir cálcio verde-5N. Para culturas de células, nós descrevemos um método de microscopia confocal, usar a tintura de Ca^{2 +} Rhod-2h.

Abstract

CA^{2 +} manipulação por mitocôndrias é uma função crítica que regulam processos fisiológicos e fisiopatológicos em um amplo espectro de células. A capacidade de medir com precisão o influxo e efluxo de Ca^{2 +} de mitocôndrias é importante para determinar a função mitocondrial Ca^{2 +} tratamento nestes processos. Neste relatório, nós apresentamos dois métodos para a medição de mitocondrial Ca^{2 +} manipulação em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Nós primeiro detalhe uma plataforma baseada em leitor de placa para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorção usando o Ca^{2 +} corante sensível cálcio verde-5N. O formato baseado em leitor de placa contorna a necessidade de equipamento especializado, e o corante verde-5N de cálcio é ideal para medição de Ca^{2 +} de mitocôndrias isoladas de tecido. Para a nossa aplicação, nós descrevemos a medição de mitocondrial Ca^{2 +} absorção em mitocôndrias isoladas de tecido do coração de rato; no entanto, este procedimento pode ser aplicado para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorção em mitocôndrias isoladas de outros tecidos como fígado, músculo esquelético e o cérebro. Em segundo lugar, descrevemos um ensaio baseado em microscopia confocal para medição de mitocondrial Ca^{2 +} em pilhas permeabilized usando o Ca^{2 +} sensível corante Rhod-2h e imagem usando microscopia de varredura a laser 2-dimensional. Este protocolo de permeabilização elimina contaminação citosólica corante, permitindo a gravação específica de alterações no mitocondrial Ca^{2 +}. Além disso, microscopia de varredura a laser permite altas taxas de quadros capturar mudanças rápidas em mitocondrial Ca^{2 +} em resposta a várias drogas ou reagentes aplicados na solução externa. Este protocolo pode ser aplicado para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorção em muitos tipos de células, incluindo as células primárias como miócitos e neurônios e linhas celulares imortalizado.

Introduction

As mitocôndrias são sites críticos de Ca^{2 +} armazenamento intracelular e sinalização. Décadas de pesquisa demonstraram que as mitocôndrias têm a capacidade de importar e sequestro de Ca^{2 + 1,2}. Mitocôndrias, no entanto, não são meramente passivas sites de armazenamento de Ca^{2 +} . CA^{2 +} no compartimento mitocondrial executa funções de sinalização fundamentais, incluindo o Regulamento da produção metabólica e ativação das vias de morte celular mediada por mitocondrial, que tem sido revisado anteriormente³. Para a regulação metabólica, Ca^{2 +} aumenta a atividade de três matriz-localizada desidrogenases do ciclo do ácido cítrico, bem como complexos da cadeia respiratória, para aumentar a produção de energia mitocondrial^4,5 . Com a sobrecarga de Ca^{2 +} mitocondrial e desregulação mitocondrial Ca^{2 +} manipulação, Ca^{2 +} disparadores transição de permeabilidade mitocondrial pore abertura (MPTP), levando a permeabilização da membrana mitocondrial interna, perda potencial de membrana, disfunção mitocondrial, inchaço, ruptura e, finalmente, da pilha morte^6,7,8,9. Assim, Ca^{2 +} sinalização mitocondrial impacta diretamente a vida celular e vias de morte através do controle metabólico e eixo MPTP-morte.

Nos últimos anos, lá tem sido rápida expansão interesse no estudo da mitocondrial Ca^{2 +} dinâmica devido, em grande parte para a identificação dos componentes moleculares do Ca^{2 +} uniporter mitocondrial complexa, um interior mitocondrial transportador de membrana que é um modo primário de Ca^{2 +} importar para a matriz mitocondrial ^10,11,12. Identificação destas subunidades estruturais e reguladoras do uniporter tem trazido a possibilidade de direcionamento geneticamente mitocondrial Ca^{2 +} influxo para modular a função mitocondrial e disfunção e facilitou o estudo do contribuição do uniporter complexo e mitocondrial Ca^{2 +} influxo a doença^13,14,15. Com efeito, Ca^{2 +} sinalização mitocondrial tem sido implicada nas patologias de um diversificado leque de doenças que variam de doença cardíaca a neurodegeneração e câncer^{16,17,18, 19,20}.

Dada a importância fundamental da mitocondrial Ca^{2 +} sinalização no metabolismo e morte celular e combinado com o amplo alcance dos sistemas biológicos que Ca^{2 +} sinalização mitocondrial impacta, métodos para avaliar mitocondrial Ca^{2 +} influxo são de grande interesse. Não surpreendentemente, desenvolveram-se uma variedade de técnicas e ferramentas para medir mitocondrial Ca^{2 +} . Estes incluem métodos que utilizam ferramentas como fluorescente Ca^{2 +}-corantes sensíveis^21,22 e geneticamente codificado Ca^{2 +} sensores direcionados para a mitocôndria, como cameleon e aequorin^{23, 24}. O objetivo deste artigo é destacar os diferentes métodos e sistemas de modelo no qual mitocondrial Ca^{2 +} absorção pode ser medida. Apresentamos dois métodos experimentais para avaliar a capacidade mitocondrial Ca^{2 +} influxo. Usando a mitocôndria cardíaca como um exemplo, detalhamos uma plataforma baseada em leitor de placa de medição mitocondrial Ca^{2 +} absorção usando o Ca^{2 +} sensível tintura verde-5N de cálcio que é ideal para mitocôndrias isoladas de tecido¹⁴ . Também utilizando culturas de células de NIH 3T3, descrevemos um ensaio baseado em imagem de microscopia confocal para medida de mitocondrial Ca^{2 +} em pilhas permeabilized usando o Ca^{2 +} sensível corante Rhod-2h²⁵.

Protocol

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comité uso da Universidade de Emory e institucional Cuidado Animal. Nota: A primeira parte é o procedimento experimental para medir mitocondrial Ca2 + influxo em mitocôndrias cardíacas isoladas usando um leitor de placa. 1. reagentes e soluções Fazer 500 mL de tampão de MS-EGTA para isolamento mitocondrial: manitol 225mm, sacarose 75 mM, o ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazin…

Representative Results

A Figura 1 mostra mitocondrial Ca2 + medidas de absorção em mitocôndrias cardíacas isoladas, utilizando a plataforma baseada em leitor de placa e o Ca2 + corante verde de cálcio-5N. Sob condições de controle (figura 1A), mitocôndrias cardíacas foram suspensos em tampão de KCl contendo cálcio verde-5N e então desafiadas com pulsos sequenciais de CaCl2 (5 μL de solução de CaCl2</…

Discussion

Aqui, descrevemos duas abordagens diferentes para medir mitocondrial Ca^{2 +} influxo. Extramitochondrial verde-5N método monitores a placa baseada em leitor de cálcio Ca^{2 +} níveis e é um Ca^{2 +} absorção ensaio que é bem adequado para medições em mitocôndrias isoladas. Enquanto mostramos resultados representativos de mitocôndrias isoladas de cardíacas murino, este ensaio pode ser facilmente adaptado para as mitocôndrias isoladas de tecidos com alta abundância mitocondrial, inclu…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440