Analisi di afflusso del calcio mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate

Summary

Qui, presentiamo due protocolli per la misurazione dell’afflusso Ca^{2 +} mitocondriale in mitocondri isolati e cellule coltivate. Per mitocondri isolati, dettagliamo un piatto basato su lettore Ca^{2 +} importazione analisi usando il Ca^{2 +} sensibili tingere del calcio verde-5N. Per le cellule coltivate, descriviamo un metodo di microscopia confocale utilizzando il Ca^{2 +} colorante Rhod-2/AM.

Abstract

CA^{2 +} gestione dai mitocondri è una funzione critica che regolano processi sia fisiologici e fisiopatologici in un ampio spettro di cellule. La capacità di misurare con precisione l’afflusso e l’efflusso di Ca^{2 +} dai mitocondri è importante per determinare il ruolo di mitocondriale Ca^{2 +} gestione in questi processi. In questo rapporto, presentiamo due metodi per la misura di mitocondriale Ca^{2 +} gestione in mitocondri isolati sia in cellule coltivate. Dettagliamo in primo luogo una piattaforma di basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento utilizzando il Ca^{2 +} colorante sensibile del calcio verde-5N. Il formato basato su lettore di piastra elude la necessità di attrezzature specializzate, e la tintura di calcio verde-5N è adatta idealmente per misura Ca^{2 +} dai mitocondri del tessuto isolato. Per la nostra applicazione, descriviamo la misurazione del mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in mitocondri isolati dal tessuto del cuore del mouse; Tuttavia, questa procedura può essere applicata per misurare mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in mitocondri isolati da altri tessuti quali fegato, muscolo scheletrico e cervello. In secondo luogo, descriviamo un saggio basato su microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca^{2 +} in celle permeabilized utilizzando il Ca^{2 +} sensibile colorante Rhod-2/AM e imaging utilizzando la microscopia a scansione laser 2-dimensionale. Questo protocollo di permeabilizzazione Elimina la contaminazione di tintura citosolico, consentendo la registrazione specifica di cambiamenti in mitocondriale Ca^{2 +}. Inoltre, microscopia a scansione laser permette un’alta frequenza di catturare rapidi cambiamenti di mitocondriale Ca^{2 +} in risposta a diversi farmaci o reagenti applicati nella soluzione esterna. Questo protocollo può essere applicato per misurare mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento in molti tipi cellulari tra cui cellule primarie quali miociti cardiaci e neuroni e linee cellulari immortalizzate.

Introduction

I mitocondri sono siti critici di intracellulare Ca^{2 +} deposito e segnalazione. Decenni di ricerche hanno dimostrato che i mitocondri hanno la capacità di importare e sequestrare il Ca^{2 + 1,2}. Mitocondri, tuttavia, non sono meramente passive siti di^{Ca 2 +} storage. CA^{2 +} presso il compartimento mitocondriale svolge funzioni di segnalazione fondamentali tra cui la regolazione della produzione metabolica e l’attivazione delle vie di morte mitocondriale-mediata delle cellule, che è stata esaminata in precedenza³. Per la regolazione metabolica, Ca^{2 +} migliora l’attività di tre deidrogenasi localizzato matrice del ciclo dell’acido tricarbossilico, nonché complessi della catena respiratoria, per aumentare la produzione di energia mitocondriale^4,5 . Con sovraccarico mitocondriale di Ca^{2 +} e dysregulated mitocondriale Ca^{2 +} movimentazione, transizione di permeabilità mitocondriale di Ca^{2 +} trigger poro apertura (MPTP), che conduceva ad permeabilizzazione della membrana mitocondriale interna, perdita potenziale di membrana, la disfunzione mitocondriale, gonfiore, rottura e in ultima analisi, delle cellule morte^6,7,8,9. Così, mitocondriale di Ca^{2 +} segnalazione direttamente influisce sia vita cellulare e le vie di morte attraverso controllo metabolico e asse di MPTP-morte.

Negli ultimi anni, c’è stato rapidamente in espansione interesse per lo studio della mitocondriale Ca^{2 +} dinamica dovuta in gran parte per l’identificazione dei costituenti molecolari del Ca^{2 +} uniporter mitocondriale complesso, un’interna mitocondriale trasportatore di membrana che è una modalità primaria di Ca^{2 +} importare nella matrice mitocondriale ^10,11,12. Identificazione di queste subunità strutturali e regolamentari del uniporter ha portato avanti la possibilità di targeting geneticamente afflusso Ca^{2 +} mitocondriale per modulare la funzione mitocondriale e disfunzione e facilitato lo studio della contributo dell’uniporter complesso e mitocondriale Ca^{2 +} afflusso a malattia^13,14,15. Infatti, Ca^{2 +} segnalazione mitocondriale è stata implicata nelle patologie di una vasta gamma di malattie che variano dalla malattia cardiaca alla neurodegenerazione e cancro^{16,17,18, 19,20}.

Data l’importanza fondamentale di mitocondriale Ca^{2 +} segnalazione nella morte delle cellule e del metabolismo e combinata con la vasta portata dei sistemi biologici che mitocondriale di Ca^{2 +} segnalazione impatti, metodi di valutazione mitocondriale Ca^{2 +} afflusso sono di grande interesse. Non sorprendentemente, sono stati sviluppati una varietà di tecniche e strumenti per misurare mitocondriale Ca^{2 +} . Questi includono metodi che utilizzano strumenti quali fluorescente Ca^{2 +}-coloranti sensibili^21,22 e geneticamente codificato Ca^{2 +} sensori mirati ai mitocondri, come cameleon ed equorina^{23, 24}. L’obiettivo di questo articolo è quello di evidenziare diversi metodi e sistemi di modello in cui mitocondriale Ca^{2 +} l’assorbimento può essere misurato. Presentiamo due metodi sperimentali per valutare la capacità mitocondriale Ca^{2 +} afflusso. Utilizzando i mitocondri cardiaci come esempio, dettagliamo una piattaforma basata su lettore di piastra per la misurazione mitocondriale Ca^{2 +} assorbimento utilizzando il Ca^{2 +} sensibili tinta del calcio verde-5N che è adatto idealmente per i mitocondri del tessuto isolato¹⁴ . Utilizzando cellule in coltura NIH 3T3, descriviamo anche un saggio di basati su formazione immagine di microscopia confocale per misura di mitocondriale Ca^{2 +} in celle permeabilized utilizzando il Ca^{2 +} sensibile colorante Rhod-2/AM²⁵.

Protocol

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato della Emory University. Nota: La prima parte è la procedura sperimentale per la misura di afflusso Ca2 + mitocondriale in mitocondri cardiaci isolati utilizzando un lettore di piastra. 1. reagenti e soluzioni Fare 500 mL di tampone di MS-EGTA per isolamento mitocondriale: 225 mM mannitolo, saccarosio di 75 mM, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-…

Representative Results

La figura 1 Mostra mitocondriale Ca2 + misure di assorbimento in mitocondri cardiaci isolati utilizzando la piattaforma basata su lettore di piastra e il Ca2 + tingere del calcio verde-5N. In condizioni di controllo (Figura 1A), i mitocondri cardiaci erano sospese in tampone di KCl contenente calcio verde-5N e poi sfidati con impulsi sequenziali di CaCl2 (5 μL di soluzione di CaCl2 0,6…

Discussion

Qui, descriviamo due diversi approcci per misurare mitocondriale afflusso di Ca^{2 +} . La piastra lettore-basato del calcio verde-5N Metodo Monitor extramitochondrial Ca^{2 +} livelli ed è una Ca^{2 +} analisi di assorbimento che è ben adatta per le misurazioni in mitocondri isolati. Mentre abbiamo dimostrato risultati rappresentativi da mitocondri cardiaci murini isolati, questo test può essere facilmente adattato per i mitocondri isolati dai tessuti con alta abbondanza mitocondriale compreso…

Materials

Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440