Gedeeltelijke lobulair Hepatectomy: Een chirurgische Model voor morfologische lever regeneratie
Summary
Hier presenteren we een nieuwe methode voor gedeeltelijke resectie van de linker hepatische kwab bij neonatale (dag 0) muizen. Dit nieuwe protocol is geschikt voor de studie van acute lever schade en letsel reactie in de neonatale instelling.
Abstract
Morfologische orgel regeneratie na acute weefsel verlies is gemeenschappelijk onder lagere gewervelde dieren, maar wordt zelden waargenomen in zoogdieren postnatale leven. Volwassen lever regeneratie na 70% gedeeltelijke hepatectomy resulteert in hepatocyte hypertrofie met sommige replicatie in resterende lobben met herstel van de metabole activiteit, maar met permanent verlies van de gewonde kwab morfologie en architectuur. Hier, detail we een nieuwe chirurgische methode in de pasgeborene die een fysiologische omgeving dat bevorderlijk is voor de regeneratie laat. Dit model omvat amputatie van de linker kwab apex en een daaropvolgende conservatieve beheer regime, en mist de noodzaak voor afbinding van grote lever schepen of chemische schade, waardoor een fysiologische omgeving waar een regeneratie kan voorkomen. Wij breiden dit protocol amputaties op jonge muizen (P7-14), waarin de benadeelde lever van orgel regeneratie tot compenserende groei door hypertrofie overgangen. Het gepresenteerd, korte 30 min-protocol biedt een kader om te bestuderen van de mechanismen van de regeneratie, de leeftijd-geassocieerde daling bij zoogdieren en de karakterisatie van vermeende hepatische stam of progenitoren.
Introduction
Het vermogen om een orgaan te regenereren, of om te herstellen van vorm en functie, is gedacht te worden meestal verloren evolutionaire mettertijd. Het regeneratieve potentieel van de volwassen zoogdieren lever na acute chemische of fysische schade is gebleken dat de mobilisatie van alle resterende hepatocyten resulterend in golven van hypertrofie en paar rondes van celdeling, wat resulteert in een functionele maar architectonisch verschillende orgel1,2,3,4,5. Studies hebben onlangs begonnen te karakteriseren de regeneratieve reactie van neonatale zoogdieren organen op schade in de eerste week van leven6,7,8. Deze studies hebben aangetoond dat wanneer gewond tijdens de ontwikkeling van de neonatologie, bepaalde zoogdieren organen met morfologische regeneratie in plaats van compenserende groei of fibrose7,8 reageren.
Recente studies is gebleken dat regeneratie van zowel de globale structuur en de functie tijdens de vroege neonatale periode6,7,8 optreedt. Gevestigde lever schade protocollen betrekken chemische schade of beheer van ethanol9,10,11, paracetamol12,13,14,15 , tetrachloorkoolstof16,17,18,19, 70% gedeeltelijke hepatectomy4,20,21, of verwijdering van links en mediane lobben. Chemische administratie leidt tot de dood van de cel van de hepatocyte, maar vaak laat micro – en macro-structuren intact. Morfologische regeneratie kan niet gemakkelijk in deze context worden bestudeerd, zoals de algemene hepatische architectuur was niet uitgewist. De gedeeltelijke hepatectomy van 70% omvat hechtdraad Afbinding van de grote schepen, die nodig is om te stoppen met bloeden, maar laat een niet-fysiologische omgeving met permanente verstoring van therapieën. Bovendien, deze methode is alleen voor volwassen knaagdieren gebruikt, en de toepassing ervan op pasgeborenen is technisch moeilijk. Met dit in het achterhoofd, ontwikkelden we een methode waarbij 20-30% van de apex van de linker kwab is verwijderd in een pasgeboren P0-muis (figuur 1A-1B). Deze methode is operatief conservatieve, minimaal invasieve, niet technisch uitdagend, en leidt tot verlies van morfologie zonder de afbinding van therapieën, ruimte wordt gelaten voor regeneratie optreden bruto. Het resulterende stapsgewijze protocol, hieronder beschreven, zorgt voor een onderzoeker voor het uitvoeren van een gedeeltelijke lobulair hepatectomy op neonatale muizen om zoogdieren neonatale regeneratie in de vroege stadia van postnatale leven te bestuderen. Deze methode heeft ook duidelijke toepassingen aan vergelijkende studies in regeneratieve geneeskunde en de biologie van de cel van de stam, als het kan worden gebruikt in de lever tijdens latere fasen van het leven.
De meest voorkomende acute lever schade studies zijn chemisch geïnduceerde schade, volwassen lever amputatie of gedeeltelijke hepatectomy van 70%. Chemische schade vaak intraveneuze, intraperitoneaal of orale toediening van paracetamol, tetrachloorkoolstof of ethanol impliceert, en is een relatief eenvoudig en niet-invasieve letsel model. Zoals eerder besproken, chemische schade resulteert in de dood van de cel van de hepatocyte, maar vaak bladeren stroma en parenchym structuren intact, waardoor het moeilijk om te maken beweringen over morfologische regeneratie. Chemische schade vaak gecentreerd op hepatische schepen, waardoor het een nuttige techniek te bestuderen van de site en cel-specifieke schade, maar maakt het ook moeilijk te ondervragen, op het niveau van de hele orgel, andere populaties die verder van schepen kan bevinden en die kan bijdragen tot regeneratie. Ondanks deze beperkingen blijft chemische schade een nuttige en zeer fysiologisch relevante schade-model.
Volwassen 70% gedeeltelijke hepatectomy houdt de verwijdering van de linker- en mediaan kwabben na Afbinding van hepatische therapieën. Het antwoord op hepatectomy was goed gekenmerkt: de geamputeerde lever 14 dagen post 70% gedeeltelijke hepatectomy een grove andere architectuur dan die van de oorspronkelijke onbeschadigd kwab, als de hepatocyten van de resterende rechts en Spiegelse kwab ontwikkelt hypertrofie en een paar rondes van celdeling4,5te ondergaan. Dit maakt verloren massa en functie, maar er niet in slaagt om te regenereren de twee geamputeerde lobben, en daarom is geen vervanging voor bruto morfologie. Dientengevolge, is de reactie van de schade op 70% gedeeltelijke hepatectomy nuttig zijn te onderzoeken van compenserende groei mechanismen met beperkte regeneratie.
Hier beschrijven we een protocol voor een neonatale gedeeltelijke lobulair hepatectomy volledig. De procedure hiervoor passende dierlijke selectie en voorbereiding, chirurgische veld voorbereiding operatie en herstel. Optimalisatie en aanpassing van elk van deze stappen kunnen worden vereist voor andere toepassingen van het protocol.
We hebben uitgebreid uitgevoerd en geoptimaliseerd dit protocol op wild type C57BL/6J pups (JAX 000664), echter studeren andere cel populaties en mechanismen van regeneratie, gebruikten we ook verschillende transgene dieren, met inbegrip van muizen herbergen verschillende Cre en CreERT2 transgenen en/of knock-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, en Sox9CreERT2 JAX 018829) in combinatie met fluorescerende verslaggevers, zoals de regenboog en mTmG systemen (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. we vonden geen behoefte om te veranderen van deze methodologie voor verschillende muis stammen, zoals geen verschillen in overleving resultaten of regeneratieve potentieel werden waargenomen.
Naast het gebruik van verschillende dierlijke variëteiten, hebben we ook gedeeltelijke lobulair hepatectomies uitgevoerd op neonatale muizen met kleine molecules, zoals 4-hydroxy-tamoxifen en 5-ethynyl-2 ‘-deoxyuridine (EdU) behandeld. Dimethylsulfoxide (DMSO) en ethanol werden gebruikt als oplosmiddelen worden gebruikt, zoals bleek dat maïsolie was een belangrijke oorzaak van morbiditeit. We anders gevonden dat intraperitoneale toediening van kleine moleculen niet overleven of regeneratieve uitkomsten beïnvloeden. We voorspellen dat dit protocol aangepast voor gebruik met andere kleine moleculen worden zal te ondervragen van verschillende aspecten van regeneratie.
Neonatale muis chirurgie kunnen technisch uitdagende en bijzondere expertise in dierlijke handling en microscopische dissectie kunnen vereisen. De veehouderij expertise is nodig om te voorkomen dat moeders kannibalisme na chirurgie en tijdens de onmiddellijke herstelperiode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Acute hepatische letsel is traditioneel bestudeerd met behulp van chemische (paracetamol, ethanol, tetrachloorkoolstof) of chirurgische modellen (70% gedeeltelijke hepatectomy). De regeneratieve reactie na gedeeltelijke hepatectomy van 70% wordt gekenmerkt om globale hepatocyte hypertrofie en meerdere rondes van celdeling4,5te betrekken. Om te stoppen bloedingen, is dit model echter beperkt, zoals de grote bloedvaten moeten worden afgebonden verlaten van een abno…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken P. Chu voor het uitvoeren van de H & E en histologie; en C. Wang en A. McCarty voor nuttige discussies. Onderzoek werd gesteund door middel van financiering van de Virginia en D. K. Ludwig Fund for Cancer Research; het nationale hart-, Long- en bloed Instituut (R01HL058770 en U01HL099999); en het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (RC1 00354) subsidies aan I.W. onder werd gesteund door het Human Frontier Science programma carrière Development Award (CDA00017), de Duitse Research Foundation (2787/1 RI), de Siebel stamcel instituut, en de Thomas en Stacey Siebel Foundation (1119368-104-GHBJI). J.M.T. werd gesteund door de NIH (T32GM007365), de National Research Service Award (1F30DK108561), en Paul en Daisy Soros Fellowship voor nieuwe Amerikanen.
Materials
| Animals | |||
| Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain) | |||
| Surrogate mother and surrogate litter (optional) | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Reagents | |||
| Phosphate Buffered Serum (PBS) | |||
| Providine-iodine or equivalent antiseptic solution | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Dissecting microscope | Zeiss | ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000 | |
| 3mm straight spring micro scissors | Vannas | 72932-01 | |
| 5SF Forceps | Dumont | 11252-00 | |
| Straight Kelly forceps | Grainger | 17-050G | |
| Heating pad | Sunbeam | 000771-810-000 | |
| Isoflurane | Abbott Labs | 0044-5260-05 | |
| Rodent Anesthesia System | Kent Scientific | 1205S | |
| Gauze, 10.16 x 10.16cm | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Equipment | |||
| 1.5ml microcentrifuge tube | Eppendorf | 22363204 | |
| 6-0 monocryl sutures | Ethicon | MCP489G | |
| Petri dish | Fisher Scientific | S35839 | |
| Pipet-Aid, Plain, 110V | Drummond | 4-000-110 | |
| Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances | Fisher Scientific | 01-912-402 | |
| Low Cost Induction Chamber | Kent Scientific | SOMNO-0730 |
References
- Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver Regeneration. Science. 276 (80), 60-66 (1997).
- Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881 (1890).
- Higgins, G., Anderson, R. M. Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).
- Miyaoka, Y., et al. Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration. Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).
- Miyaoka, Y., Miyajima, A. To divide or not to divide: revisiting liver regeneration. Cell Div. 8, 8 (2013).
- Tsai, J. M., et al. Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Shyh-Chang, N., et al. Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism. Cell. 155, 778-792 (2013).
- Yin, M., et al. Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice. Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).
- Gao, B., Bataller, R. Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets. Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).
- Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 34, 101-108 (2001).
- Coen, M., et al. An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy. Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).
- Oz, H. S., et al. Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity. J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).
- Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver. Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).
- Gunawan, B. K., et al. c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity. Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).
- Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a. Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review. J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).
- Recknagel, R. O., Glende, E. a., Dolak, J. a., Waller, R. L. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).
- Sell, S. Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells. Hepatology. 33, 738-750 (2001).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).
- Greene, A. K., Puder, M. Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management. J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse. Genesis. 605, 593-605 (2007).
- Poley, W. Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice. Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).
- Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice. Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).
