Een eiwit Microarray Assay voor serologische bepaling van antigeen-specifieke antilichaam reacties volgende Clostridium difficile -infectie

Summary

Dit artikel bevat een beschrijving van een eenvoudige eiwit microarray methode voor profilering humorale immuunreacties aan een 7-plex panel van sterk gezuiverd Clostridium difficile antigenen in menselijke sera. Het protocol kan worden uitgebreid voor de bepaling van specifieke antilichaam reacties in preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline.

Abstract

Wij bieden een gedetailleerd overzicht van een nieuwe high-throughput eiwit microarray test voor de bepaling van anti –Clostridium difficile antilichaam niveaus in menselijke sera en in afzonderlijke preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline (IVIg). Het protocol beschrijft de methodologische stappen die betrokken zijn bij de bereiding van de monsters, afdrukken van matrices, assay procedure en data-analyse. Bovendien, kan dit protocol verder worden ontwikkeld om te nemen van uiteenlopende klinische monsters, met inbegrip van plasma en supernatant van cultuur van de cel. We laten zien hoe eiwit microarray kan worden gebruikt om te bepalen van een combinatie van isotype (IgG, IgA, IgM), subklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), en stam-specifieke antilichamen tegen sterk gezuiverd hele C. difficile toxines A en B (toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotype 087), toxine B van een C. difficile toxine-B-only waarin stam (CCUG 20309), een vorm van de voorloper van een B-fragment van binaire toxine, pCDTb, ribotype-specifieke hele toplaag eiwitten (SLPs; 001, 002, 027), en de controle van eiwitten (tetanus tetanustoxoïd en Candida albicans). Tijdens het experiment zijn microarrays gesondeerd met sera uit individuen met C. difficile infectie (CDI), mensen met cystic fibrosis (CF) zonder diarree, gezonde controles (HC), en individuen pre en post-IVIg therapie voor de behandeling van chronische inflammatoire demyeliniserende polyradiculopathy, CDI en gecombineerde immunodeficiëntie stoornis. We ondervinden aanzienlijke verschillen in toxine neutralisatie efficacies en multi-isotype specifiek antilichaam niveaus tussen patiëntengroepen, commerciële preparaten van IVIg, en sera vóór en volgende IVIg administratie. Ook is er een significante correlatie tussen microarray en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor antitoxine IgG niveaus in serummonsters. Deze resultaten suggereren dat microarray een veelbelovend instrument voor profiling van antilichaam reacties op C.difficile antigenen in gevaccineerde of besmette mensen zou kunnen worden. Met de verdere verfijning van antigeen panelen en een afname van de productiekosten verwachten we dat microarray technologie helpen kan optimaliseren en selecteer de klinisch meest nuttige immuuntherapie voor C. difficile -infectie in een patiënt-specifieke wijze.

Introduction

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een nieuwe en aangepaste eiwit microarray assay voor het opsporen en semi-kwantificering van bacteriële stam en isotype-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen. Wij gebruiken met succes onze C. difficile-specifieke microarray assay als een veelbelovend nieuw hulpmiddel voor de compositorische bioanalyse van specifieke antilichaam inhoud in patiënt sera^1,2, bereidingen van IVIg³, en identificatie van specifieke kenmerken van antilichaam die met de slechte resultaten in de CDI^{4 correleren}. We laten zien hoe biobanked serummonsters en commerciële preparaten van IVIg kunnen worden geanalyseerd op microarray dia’s, waardoor hoge kwaliteit reproduceerbaar profilering van C. difficile pathogeen-specifieke antilichaam reacties in deze test.

Veel gezonde kinderen en volwassenen hebben detecteerbare serum IgG- en IgA-antilichamen tegen C. difficile toxines A en B^5,6. Deze worden verondersteld te ontstaan naar aanleiding van voorbijgaande blootstelling tijdens kinderschoenen en na blootstelling aan C. difficile in de volwassenheid. Om deze reden polyklonale IVIg is afwijkend gebruikt voor de behandeling van recidiverende zowel fulminant CDI^7,8,9. Echter, haar definitieve rol en werkingsmechanisme is onduidelijk. Verschillende studies hebben aangetoond dat de humorale immune reactie op toxines van C. difficile een rol bij ziekte presentatie en resultaat speelt. Specifiek, weergeven asymptomatische patiënten een verhoogde anti-toxine A IgG serumconcentratie vergeleken met patiënten die de ontwikkeling van de symptomatische ziekte¹⁰ Een aantoonbare vereniging is gemeld voor de mediane anti-toxine A IgG titers en 30-daagse all-cause mortality¹¹. Verscheidene verslagen is ook gebleken dat een associatie met een bescherming tegen herhaling en antilichaam reacties op het toxine A, B en verschillende niet-toxine antigenen (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD en toplaag eiwitten (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. deze opmerkingen hebben aangespoord de ontwikkeling van de eerste passieve immunotherapie drug-toxine met targeting C. difficile B (bezlotuxumab), dat onlangs is goedgekeurd door de US Food and Drug Administration en het Europees Geneesmiddelenbureau Agentschap voor het voorkomen van terugkerende CDI¹⁶. Vaccinatiestrategieën door middel van geïnactiveerd toxines of recombinante toxine fragmenten zijn ook momenteel in ontwikkeling^17,18,19. Deze nieuwe therapeutische benaderingen zullen ongetwijfeld het stimuleren van de eis voor de evaluatie van de humorale immuunreacties aan meerdere antigenen in grote steekproeven.

Vandaag, is er een opmerkelijke gebrek verkrijgbare high-throughput assays staat gelijktijdig bacteriële stam en isotype-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen. Er is een unmet behoefte aan het ontwikkelen van deze gehaltebepalingen om toekomstige onderzoeksinspanningen en klinische toepassingen te vergemakkelijken. Eiwit microarrays is een methode om grote aantallen van individueel gezuiverd eiwitten als een ruimtelijk georganiseerde matrix van plekken op een microscopische dia gebaseerde oppervlak te immobiliseren met behulp van een robot systeem, dat een contact²⁰ of een contactloze zijn kan gereedschap²¹afdrukken. De plekken kunnen complexe mengsels zoals cel lysates, antilichamen, weefsel homogenates, endogene of recombinante eiwitten peptiden, lichaamsvloeistoffen of drugs^22,23vertegenwoordigen.

Eiwit microarray technologie biedt duidelijke voordelen boven standaard in-house ELISA technieken, die van oudsher gebruikt hebben om te beoordelen van de anti –C. difficile antilichaam reacties. Deze omvatten een grotere capaciteit voor het opsporen van een aantal multi-isotype-specifieke antistoffen tegen een uitgebreidere panel van eiwit doelen, verminderde volume eisen voor antigenen, monsters en reagentia, en een verbeterde mogelijkheid om te integreren in een groter aantal technische replicatieonderzoeken, naast meerdere interne kwaliteitscontrole (QC) meet¹. Microarrays zijn daarom meer gevoelige, nauwkeurig en reproduceerbaar en hebben een groter dynamisch bereik. Deze factoren maken microarrays een goedkoper en potentieel gunstige alternatief voor ELISAs voor de grootschalige opsporing van bekende eiwitten. Nadelen van microarray technologie leidt echter tot voornamelijk uit de grote up-front kosten in verband met de oprichting van een panel van hoogst gezuiverde antigenen en het opzetten van het technologische platform.

Eiwit microarrays zijn uitgebreid gebruikt in de afgelopen twee decennia als een onderzoeksinstrument van de diagnostische en fundamenteel in klinische toepassingen. Specifieke toepassingen omvatten eiwit expressie profilering, de studie van enzym-substraat relaties, biomerker screening, analyse van host-microbe interacties, en profiling van antilichaam specificiteit^{23,24, 25,26,27,28}. Veel nieuwe pathogen eiwit/antigeen microarrays zijn vastgesteld, met inbegrip van malaria (Plasmodium)²⁹, HIV-1³⁰, influenza³¹, ernstig acuut respiratoir syndroom (SARS)³², virale hemorragische koorts³³ , infectieziekte³⁴en³⁵van de tuberculose.

Dit protocol heeft betrekking op de oprichting van een eenvoudige operationele C. difficile reactieve antigeen microarray assay, waarmee specifieke, nauwkeurige en precieze kwantificering van multi-isotype en stam-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen in sera en polyclonal IVIg. Wij zijn hierin, representatieve resultaten met betrekking tot een aanvaardbaar microarray assay prestaties in vergelijking met ELISA evenals assay nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de techniek van profielen. Deze bepaling verder kan worden ontwikkeld om het profiel van andere klinische monsters en zet een nieuwe standaard voor onderzoek naar de moleculaire basis van de CDI.

Protocol

1. voorbereiden van een plaat van Microarray C. difficile antigenen met een afdrukken buffer [PBS-Tween-trehalose (50 mM)] op de optimale concentratie (die was vooraf gedefinieerd voordat u de patiënt sera) verdund: toxine een (200 µg/mL) en toxine B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), en gezuiverde native hele SLPs afgeleid van ribotypes 001, 002 en 027 (200 µg/mL).Opmerking: Toxine B is verkregen uit een toxine B-uiten stam CCUG 20309 (90 µg/mL). De positieve controle, lysates van C…

Representative Results

Figuur 1 illustreert een stroomdiagram met een beschrijving van de belangrijkste stappen in het protocol beschreven. Figuur 2 toont Spearman correlatie proeven waarmee belangrijke overeenkomst tussen microarray en ELISA voor IgG- en IgA anti-toxine A en B niveaus in de patiënt testsera is aangetoond. Figuur 3 toont differentiële IgG- en IgA antilichaam-klasse specifiek antilichaam reacties op het t…

Discussion

In dit protocol hebben we aangetoond dat microarray is een geschikt platform voor het definiëren van humorale immuunreacties aan C. difficile eiwit antigenen patiënt sera (cijfers 3 en 6) en commerciële preparaten van IVIg (Figuur 5). We hebben ook aangetoond dat de techniek van microarray presteert goed vergeleken met conventionele ELISA (Figuur 2) en uitstekende reproduceerbaarheid, toont met intra – en intersite -…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A