Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Protein Microarray Methode für Clostridium Difficile Antigene im menschlichen Serum Profilerstellung humorale Immunantworten auf einer 7-Plex Jury hoch gereinigt werden. Das Protokoll kann zur Bestimmung der spezifischen Antikörperantworten in die Vorbereitungen der polyklonalen intravenöses Immunglobulin erweitert werden.

Abstract

Wir bieten eine detaillierte Übersicht über ein neuartiges Hochdurchsatz-Protein-Microarray-Assay für die Bestimmung der Anti –Clostridium Difficile -Antikörpern im menschlichen Serum und in separaten Vorbereitungen von polyklonalen intravenöses Immunglobulin (IVIg). Das Protokoll beschreibt die methodischen Schritte zur Probenvorbereitung, Druck von Arrays, Testverfahren und Datenanalyse. Darüber hinaus könnte dieses Protokolls weiter ausgebaut werden, um vielfältigen klinischen Proben einschließlich Plasma und Zell-Kultur Überstände. Wir zeigen, wie Protein Microarray verwendet werden kann, um festzustellen, eine Kombination aus Isotype (IgG, IgA, IgM), Unterklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2) und Stamm-spezifische Antikörper gegen hoch gereinigt ganze C. Difficile Toxin A und B (Toxinotype 0, Stamm VPI 10463, ribotyp 087), Toxin B aus einem C. Difficile Toxin-B-nur mit dem Ausdruck ihrer Stamm (CCUG 20309), eine Vorstufe-Form eines B-Fragments des binären Toxins, pCDTb, ribotyp-spezifische ganze Oberflächenschicht Proteine (SLPs, 001, 002, 027), und Steuern Proteine (Tetanus Toxoid und Candida Albicans). Während des Experiments sind Microarrays sondiert mit Sera von Einzelpersonen mit C. Difficile -Infektion (CDI), Einzelpersonen mit Cystischer Fibrose (CF) ohne Durchfall, gesunden Kontrollpersonen (HC), und von Einzelpersonen Pre- und Post-IVIg Therapie für die Behandlung von CDI, kombinierte Immundefizienz Unordnung und chronisch entzündliche demyelinisierende polyradikulopathie. Wir begegnen erhebliche Unterschiede in Toxin Neutralisation Wirksamkeiten und Multi-Isotype spezifischen Antikörpertiter Patientengruppen, kommerzielle Vorbereitung der IVIg, und Sera vor und nach IVIg Verabreichung. Außerdem gibt es eine signifikante Korrelation zwischen Microarray und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) für Antitoxin-IgG-Werte in Serumproben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Microarray ein viel versprechendes Instrument für die Profilerstellung Antikörperantworten auf C.difficile Antigene in geimpften oder infizierten Menschen werden könnte. Mit der Verfeinerung der Antigen-Panels und eine Reduzierung der Produktionskosten rechnen wir Microarray-Technologie optimieren und wählen Sie die klinisch nützlichen Immuntherapien für C. Difficile Infektion in einer Patienten-spezifischen Weise helfen kann.

Introduction

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung und Validierung eines neuartigen und kundenspezifische Protein Microarray Assays für die Erkennung und semi-Quantifizierung der Bakterienstamm und Isotype-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile -Antigene. Wir nutzen erfolgreich unsere C. Difficile-spezifische Microarray-Assay als viel versprechende neue Werkzeug für die kompositorische Bioanalytik der spezifischen Antikörper Inhalte in Patientenseren^1,2, Vorbereitungen von IVIg³, und Kennung der Antikörper-Besonderheiten, die mit schlechten Ergebnissen im CDI⁴korrelieren. Wir zeigen wie Biobanked Serumproben und kommerzielle Vorbereitung der IVIg auf Microarray Folien, analysiert werden können, ermöglicht qualitativ hochwertige reproduzierbare profiling von C. Difficile Erreger-spezifischen Antikörper-Reaktionen in diesem Assay.

Viele gesunde Kinder und Erwachsene haben nachweisbar Serum IgG und IgA Antikörper gegen C. Difficile Toxine A und B^5,6. Diese werden gedacht, um nach vorübergehender Exposition in der Kindheit und nach Exposition gegenüber C. Difficile im Erwachsenenalter auftreten. Aus diesem Grund wurde polyklonale IVIg off-Label-zur Behandlung von wiederkehrenden und fulminanten CDI^7,8,9verwendet. Seine endgültige Rolle und Wirkungsweise bleibt jedoch unklar. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Humorale Immunantwort auf C. Difficile Toxine in Krankheit Präsentation und das Ergebnis eine Rolle spielt. Insbesondere zeigen asymptomatische Patienten eine erhöhte Serum Anti-Toxin A IgG Konzentration im Vergleich zu Patienten, die Symptomen der Krankheit¹⁰zu entwickeln. Eine nachweisbare Verbindung wurde für mittlere Anti-Toxin-A IgG-Titer und 30-Tage Mortalität aller Ursachen¹¹berichtet. Mehrere Berichte haben auch gezeigt, dass eine Vereinigung mit einem Schutz gegen Rezidive und Antikörper Reaktionen auf Toxin A, B und mehrere nicht-Toxin-Antigene (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD und Oberflächenschicht Proteine (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. diese Beobachtungen haben die Entwicklung der ersten passiven Immuntherapie Drug targeting C. Difficile Toxin B (Bezlotuxumab), die vor kurzem von der US Food and Drug Administration und die Europäische Arzneimittel-Agentur genehmigt wurde angespornt Agentur für die Prävention von wiederkehrenden CDI¹⁶. Impfstrategien mit inaktivierten Toxinen oder rekombinantes Toxin Fragmente sind auch derzeit in der Entwicklung^17,18,19. Diese neue Therapieansätze werden zweifellos die Voraussetzung für die Bewertung der humoralen Immunantwort auf mehrere Antigene in große Stichprobenumfänge stimulieren.

Heute gibt es ein bemerkenswerten Mangel an handelsüblichen Hochdurchsatz-Assays in der Lage, gleichzeitig Bakterienstamm und Isotype-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile -Antigene zu beurteilen. Es besteht ein ungedeckter Bedarf, solche Tests Erleichterung künftiger Forschung und klinische Anwendungen zu entwickeln. Protein Microarrays sind eine Methode, um große Anzahl von einzeln-gereinigte Proteine als räumlich organisierten Array von Flecken auf einer mikroskopischen folienbasierten Oberfläche zu immobilisieren, mit einem Robot-System, die entweder ein Kontakt²⁰ oder ein berührungsloses sein kann Drucken Tool²¹. Die Spots können komplexe Mischungen wie Zelle Lysates, Antikörper, Gewebe Homogenates, endogenen oder rekombinante Proteine oder Peptide, Körperflüssigkeiten oder Drogen^22,23darstellen.

Protein-Microarray-Technologie bietet deutliche Vorteile gegenüber standard im Haus ELISA-Techniken, die traditionell verwendet wurden, um Anti –C. Difficile Antikörperantworten zu beurteilen. Dazu gehören eine erhöhte Kapazität für eine Reihe von Multi-Isotype-spezifische Antikörper gegen eine umfangreichere Gruppe von Protein-Targets, geringerer Anforderungen für Antigene, Proben und Reagenzien, Erkennung und eine verbesserte Fähigkeit, eine größere integrieren Anzahl der technischen Replikationen, zusätzlich mehrere interne Qualitätskontrolle (QC) misst¹. Microarrays sind daher sensibel, präzise und reproduzierbare und haben einen größeren Dynamikbereich. Diese Faktoren machen Microarrays eine billigere und potenziell günstige Alternative zu ELISAs für die groß angelegte Erkennung von bekannten Proteinen. Jedoch Nachteile der Microarray-Technologie resultieren im Wesentlichen aus der große Vorabkosten zugeordnet zur Gründung einer Gruppe von hochgereinigten Antigenen und die technologische Plattform einrichten.

Protein Microarrays haben in den letzten zwei Jahrzehnten als Diagnose- und grundlegende Recherche-Tool in der klinischen Anwendung intensiv genutzt. Spezielle Anwendungen sind Protein-Expression profiling, das Studium der Enzym-Substrat-Beziehungen, Biomarker Screening, Analyse von Host-Mikroben-Interaktionen und profiling Antikörper Spezifität^{23,24, 25,26,27,28}. Viele neue Erreger Protein/Antigen Microarrays entstanden unter anderem Malaria (Plasmodium)²⁹, HIV-1³⁰, Grippe³¹, schwere akute respiratorische Syndrom (SARS)³², virale hämorrhagische Fieber^33, , Herpesviren³⁴und Tuberkulose³⁵.

Dieses Protokoll bezieht sich auf die Einrichtung eine einfach operative C. Difficile reaktive Antigen Microarray Assay, ermöglicht präzise, genaue und spezifische Quantifizierung der Multi-Isotype und Stamm-spezifischen Antikörper-Reaktionen auf C. Difficile Antigene in Sera und polyklonalen IVIg. Hier zählen wir repräsentative Ergebnisse in Bezug auf eine akzeptable Microarray Testleistung im Vergleich zu ELISA sowie Assay-Präzision und Reproduzierbarkeit Profile. Dieser Test könnte weiter entwickelt werden, um andere klinikmustern Profil und setzt einen neuen Standard für die Forschung in der molekularen Grundlagen des CDI.

Protocol

1. Vorbereitung einer Microarray-Platte C. Difficile Antigene mit einem Drucken Puffer [PBS-Tween-Trehalose (50 mM)] bei der optimalen Konzentration (das vordefiniert wurde vor dem Ausführen der Patientenseren) verdünnen: Toxin ein (200 µg/mL) und Toxin B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL) und gereinigte Native ganze SLPs abgeleitet ribotypen 001 und 002 027 (200 µg/mL).Hinweis: Toxin B war ein Toxin B exprimierenden Stamm CCUG 20309 (90 µg/mL) entnommen. Die Positivkontrollen Lysates vo…

Representative Results

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm, beschreibt die wichtigsten Schritte in der beschriebenen Protokoll. Abbildung 2 zeigt Spearman Korrelationstests zeigen bedeutende Abkommen zwischen Microarray und ELISA für IgG und IgA Anti-Toxin A und B im Patiententest Sera Ebenen. Abbildung 3 zeigt differenzierte IgG und IgA Antikörper-Klasse spezifische antikörperreaktionen auf Toxin A und Toxin B binäres…

Discussion

In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass diese Microarray eine geeignete Plattform für die Humorale Immunantwort auf C. Difficile -Protein-Antigene in Patientenseren (Abbildungen 3 und 6) und kommerzielle Vorbereitung der IVIg (Abbildung 5) Definition ist. Wir haben auch gezeigt, dass die Microarray-Technik führt auch im Vergleich zu konventionellen ELISA (Abbildung 2) und zeigt hervorragende Reproduzierbarkeit mit…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A