항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

Summary

이 문서 Clostridium 남과 어울리지 않는 항 원에 인간 세라 정화 7-플렉스 패널의 체액 면역 반응 높은 프로 파일링에 대 한 간단한 단백질 microarray 메서드를 설명 합니다. Polyclonal 정 맥 면역 글로불린의 준비에 특정 항 체 반응의 결정에 대 한 프로토콜을 확장할 수 있습니다.

Abstract

우리Clostridium 남과 어울리지 않는 항 체 수준의 polyclonal 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)의 별도 준비와 인간의 세라에서의 안티-결정에 대 한 소설 높은 처리량 단백질 microarray 분석 결과 대 한 자세한 개요를 제공합니다. 프로토콜 샘플 준비, 배열, 시험 절차, 및 데이터 분석의 인쇄에 관련 된 방법론 단계를 설명합니다. 또한,이 프로토콜 플라즈마를 포함 한 다양 한 임상 샘플을 통합 하 고 문화 supernatants 셀을 더 개발 될 수 있습니다. 우리는 단백질 microarray를 사용 하 여 isotype (IgG, IgA, IgM), 서브 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2)의 조합을 결정 하는 방법을 보여 및 스트레인-특정 항 체를 매우 전체 C. 남과 어울리지 않 는 정화 독 소 A와 B (toxinotype 0, 스트레인 VPI 10463, ribotype 087), C. 남과 어울리지 않는 독 소 B만 표현 스트레인 (CCUG 20309)에서 독 소 B, 이진 독 소, pCDTb, ribotype 특정 전체 표면 층 단백질 B 조각의 선구자 형태 (SLPs; 001, 002, 027), 단백질 (파상풍을 제어 사망 toxoid 그리고 Candida albicans)입니다. 실험 기간 동안 microarrays 세라 C. 감염과 (CDI), 낭 성 섬유 증 (CF) 설사, 건강 한 컨트롤 (HC), 없이 개인으로 개인 및 개인 사전 및 포스트 IVIg 치료와 함께 조사 됩니다는 CDI, 결합 된 면역 결핍 장애 및 만성 염증 demyelinating polyradiculopathy의 치료. 우리 환자 단체, IVIg, 그리고 전에 세라의 상업적인 준비와 다음 IVIg 관리 사이 독 소 중립화 신진대사 및 멀티 isotype 특정 항 체 수준에 큰 차이가 발생합니다. 또한, 있다 microarray 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 사이의 중요 한 상관 관계 항 독 소 IgG 수준에 대 한 혈 청 샘플에서. 이러한 결과 microarray 예방 접종 또는 감염 된 인간 C.difficile 항 원에 항 체 응답을 프로 파일링 하기 위해 유망한 도구가 될 수 것이 좋습니다. 항 원 패널과 생산 비용에 있는 감소의 더 수정, 우리는 microarray 기술을 최적화 하 고 환자 별로 C. 감염과 대 한 가장 임상적으로 유용한 immunotherapies를 선택 도움이 될 수 있습니다 예상.

Introduction

이 프로토콜 개발 및 검출을 위한 소설과 맞춤형 단백질 microarray 분석 결과의 검증 및 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답의 반 정량화에 설명합니다. 우리는 성공적으로 우리의 C. 남과 어울리지 않는 사용-특정 항 체 환자 세라^1,2, IVIg³, 준비에에서 콘텐츠 구성 bioanalysis 유망한 새로운 툴으로 서 분석 결과 특정 microarray 및 CDI⁴가난한 결과 연관 항 체 특이성의 식별. 시연 어떻게 biobanked 혈 청 샘플 및 IVIg의 상업적인 준비 microarray 슬라이드에 분석 될 수 있다 C. 남과 어울리지 않는 병원 체 특정 항 체 반응을이 분석 결과의 높은-품질 프로 파일링를 재현할 수 있도록 합니다.

많은 건강 한 아이 들 및 성인 있고 C. 남과 어울리지 않는 독 소 A에 감지 혈 청 IgG와 IgA 항 체 B^5,6. 이러한 초기와 성인에서 C. 남과 어울리지 않 는 노출 다음 중 과도 노출 다음 발생 생각 된다. 이러한 이유로, polyclonal IVIg 되었습니다 재발 및 fulminant CDI^7,,89치료에 오프 라벨을 사용. 그러나, 그것의 확실 한 역할 그리고 행동의 모드 불분명 남아 있습니다. 몇 가지 연구는 C. 남과 어울리지 않는 독 소를 체액 면역 반응에서 역할을 질병 프레 젠 테이 션 및 결과 나타났습니다. 특히, 무 증상 환자 증상 질병¹⁰을 개발 하는 환자에 비해는 증가 혈 청 항 독 소 A IgG 농도 표시. 명백한 협회 중간 항 독 소 A IgG titers 및 30 일 모든 원인 사망¹¹보고 되었습니다. 여러 보고서 또한 독 소 A, B, 그리고 여러 비 독 소 항 (Cwp66, Cwp84, 플, FliD, 및 표면 층 단백질 (SLPs)) 재발과 항 체 응답에 대 한 보호와 연결을 계시 했다^{12,13 , 14 , 15}. 이러한 관측을가 했다가 개발의 첫 번째 수동 immunotherapy 마약 대상 C. 남과 어울리지 않는 독 소 B (bezlotuxumab)는 최근 미국 식품 의약품 안전 청 및 유럽 의약품에 의해 승인 되었습니다 재발 CDI¹⁶의 예방을 위한 기관. 사 독 소 또는 재조합 독 소 조각을 사용 하 여 예방 접종 전략은 또한 현재 개발^17,,1819에서. 이러한 새로운 치료 접근 의심할 여 지 없이 큰 샘플 크기에 여러 항 원에 체액 성 면역 반응 평가 대 한 요구를 자극할 것 이다.

오늘날, 세균성 긴장 및 C. 남과 어울리지 않는 항 원에 항 체 isotype-특정 응답을 동시에 평가 가능 상업적으로 사용 가능한 높은 처리량 분석 실험의 주목할 만한 부족이 있다. 미래 연구 및 임상 응용을 촉진 하기 위하여 이러한 분석을 개발 하는 충족 되지 필요가 있다. 단백질 microarrays는 현미경 슬라이드 기반 표면에 반점의 공간적 조직 배열로²⁰ 접촉 또는 비 접촉 될 수 있는 로봇 시스템을 사용 하 여 개별적으로 순화 된 단백질의 많은 수를 무력화 하는 방법 인쇄 도구²¹. 관광 명소는 세포 lysates, 항 체, 조직 homogenates, 내 인 성 또는 재조합 형 단백질 또는 펩 티 드, 체액 또는 약물^22,23등 복잡 한 혼합물을 나타낼 수 있습니다.

단백질 microarray 기술 표준 사내 ELISA 뚜렷한 장점이 안티-C. 남과 어울리지 않는 항 체 응답을 평가 하기 위해 전통적으로 사용 된 기술을 제공 합니다. 이들은 다양 한 단백질 목표, 항 원, 예제 및 시 약에 대 한 요구 사항 감소 볼륨의 더 광범위 한 패널에 대 한 멀티-isotype-특정 항 체를 탐지 하기 위한 용량 증가 및 더 큰 통합 향상된 된 능력 기술 복제 뿐만 아니라 여러 내부 품질 관리 (QC)의 수¹를 측정합니다. Microarrays는 따라서 더 정확한, 과민 하 고 재현할 수 있고 큰 동적 범위. 이러한 요인 microarrays는 저렴 하 고 잠재적으로 유리한 대안 ELISAs 알려진된 단백질의 대규모 검색에 대 한 확인합니다. 그러나, microarray 기술의 단점 매우 순화 된 항 원의 패널 구축 및 기술 플랫폼을 설정 관련 된 큰 초기 비용에서 주로 유래한 다.

단백질 microarrays 임상 응용 프로그램에 진단 및 기본 연구 공구로 지난 2 년간 광범위 하 게 사용 되었습니다. 단백질 발현 프로 파일링, 효소-기질 관계, 바이오 마커 검사, 호스트-미생물 상호작용의 분석의 연구 및 항 체 특이성^23,24, 프로 파일링을 포함 하는 특정 응용 프로그램 ^25,26,,2728. 말라리아 (변형 체)²⁹, 에이즈-1³⁰,³¹독감, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)³², 바이러스 성 출혈 성 열^{33 포함 하 여 많은 새로운 병원 체 단백질/항 microarrays 설립 되었습니다.} , herpesviruses³⁴및 결핵³⁵.

현재 프로토콜 쉬운 운영 C. 남과 어울리지 않 는 반응 항 원 microarray 분석 결과, 멀티 isotype 및 c.에 대 한 스트레인 특정 항 체 응답의 정밀, 정확 하 고 특정 정량화를 가능 하 게의 설립에 관한 남과 어울리지 않는 세라와 IVIg polyclonal 항 원. 여기, 우리는 프로필 ELISA 분석 결과 정밀도 및 재현성에 비해 허용 microarray 분석 결과 성능에 관한 대표적인 결과 포함 합니다. 이 분석 결과 다른 임상 샘플 프로 파일링에 더 개발 될 수 있습니다 고 CDI의 분자 기준으로 연구에 대 한 새로운 표준을 설정 합니다.

Protocol

1. 준비 Microarray 플레이트 (이 환자 세라를 실행 하기 전에 미리 정의 된) 최적 농도에서 인쇄 버퍼 [PBS-트윈-트 레 할 로스 (50mm)] C. 남과 어울리지 않는 항 원 희석: 독 소는 (200 µ g/mL) 및 독 소 B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL), 및 순화 된 네이티브 전체 SLPs ribotypes 001, 002, 027 (200 µ g/mL)에서 파생 된.참고: 독 소 B 독 소 B 표현 스트레인 CCUG 20309 (90 µ g/mL)에서 얻은 것입니다. 긍정적?…

Representative Results

그림 1 설명된 프로토콜의 주요 단계를 설명 하는 순서도를 보여 줍니다. 그림 2 는 상당한 사이 계약 microarray ELISA IgG와 IgA 항 독 소 A와 B 환자 테스트 세라 수준을 보여주는 Spearman 상관 관계 테스트. 그림 3 설사 없이 CF 환자, 설사, CDI 환자와 HC에서 독 소 A, B, 독 소 및 이진 독 (pCDTb)에 대 한 특정 항 체 응?…

Discussion

이 프로토콜에서 우리는 microarray C. 남과 어울리지 않 는 단백질 항 원 환자 세라 (그림 3 과 6)와 IVIg (그림 5)의 상업적인 준비에 체액 성 면역 응답을 정의 하기 위한 적합 한 플랫폼입니다 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 microarray 기술은 기존의 ELISA (그림 2)에 비교 될 때 잘 수행 하 고 내부 및 남북 assay variabilities 정?…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A