Um ensaio de Microarray da proteína para determinação sorológica do antígeno-específicas anticorpo respostas seguintes Clostridium difficile infecção

Summary

Este artigo descreve um método de microarray de proteína simples para perfilação humorais respostas imunes a um painel de 7-plex de altamente purificado antígenos de Clostridium difficile em soros humanos. O protocolo pode ser estendido para a determinação de respostas de anticorpos específicos em preparações de imunoglobulina intravenosa policlonal.

Abstract

Nós fornecemos uma visão detalhada de um ensaio de microarray de romance da elevado-produção de proteínas para a determinação de antiníveis de anticorpos deClostridium difficile em soros humanos e em preparações separadas de polyclonal imunoglobulina intravenosa (IVIg). O protocolo descreve as etapas metodológicas envolvidas na preparação de amostra, impressão de matrizes, procedimento de ensaio e análise de dados. Além disso, este protocolo pode ser desenvolvido para incorporar diversas amostras clínicas incluindo plasma e sobrenadantes. Mostramos como proteína microarray pode ser usado para determinar uma combinação de isotipo (IgG, IgA, IgM), subclasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), e anticorpos específicos de estirpe altamente purificado toda c. difficile toxinas A e B (toxinotype-0, estirpe VPI ribotype 10463, 087), toxina B de uma c. difficile toxina B-somente expressando estirpe (CCUG 20309), uma forma de precursor de um fragmento B da toxina binária, pCDTb, proteínas de toda a superfície da camada de ribotype específicos (SLPs; 001, 002, 027) e controle de proteínas (tétano tetânico e Candida albicans). Durante o experimento, microarrays são analisados com soros de indivíduos com infecção por c. difficile (CDI), os indivíduos com fibrose cística (CF), sem diarreia, controles saudáveis (HC) e de indivíduos pré e post-IVIg terapia para o tratamento de transtorno de imunodeficiência combinada, CDI e polyradiculopathy desmielinizante inflamatória crônica. Encontramos diferenças significativas de eficácias de neutralização de toxina e níveis de anticorpos específicos de multi-isotipo entre grupos de pacientes, preparações comerciais de IVIg e sera antes e após a administração IVIg. Além disso, há uma correlação significativa entre microarray e ensaio imunoenzimático (ELISA) para os níveis de IgG antitoxina em amostras de soro. Estes resultados sugerem que microarray pode se tornar uma ferramenta promissora para o perfilamento respostas de anticorpos para antígenos de c nos seres humanos infectados ou vacinados. Com mais refinamento de painéis de antígeno e uma redução nos custos de produção, prevemos que tecnologia microarray pode ajudar a otimizar e selecione as imunoterapias mais clinicamente útil para c. difficile infecção de forma paciente específico.

Introduction

Este protocolo descreve o desenvolvimento e validação de um ensaio de microarray de proteína romance e personalizado para a deteção e a quantificação semi da estirpe bacteriana e respostas específicas do isotipo do anticorpo aos antígenos de c. difficile . Utilizamos com êxito o nosso c. difficile-ensaio de microarray específico como uma nova ferramenta promissora para a Bioanálise composicional de conteúdo de anticorpos específicos no soro dos doentes^1,2, preparações de IVIg³, e identificação das especificidades de anticorpos que correlacionam com resultados pobres em CDI⁴. Demonstramos como amostras de soro biobanked e preparações comerciais de IVIg podem ser analisadas em slides de microarray, permitindo alta qualidade reprodutível caracterização das respostas de anticorpos específicos do patógeno c. difficile neste ensaio.

Muitas crianças saudáveis e adultos têm anticorpos IgG e IgA detectável soro c. difficile toxinas A e B^5,6. Estes são pensados para surgir na sequência de exposição transitória durante a infância e após a exposição a c. difficile na idade adulta. Por esta razão, IVIg policlonal tem sido utilizado off-label para tratar recorrentes e fulminante CDI^7,8,9. No entanto, seu papel definitivo e modo de ação ainda não está claro. Vários estudos têm mostrado que a resposta imune humoral a c. difficile toxinas desempenha um papel na apresentação da doença e dos resultados. Especificamente, pacientes assintomáticos mostram uma aumento anti-toxina IgG A concentração sérica comparada aos pacientes que desenvolvem doença sintomática¹⁰. Relatou-se uma associação demonstrável para títulos de IgG A anti-toxina medianos e mortalidade 30 dias¹¹. Vários relatórios também revelaram uma associação com uma proteção contra a recorrência e anticorpo respostas a toxina A, B e vários antígenos não-toxina (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD e proteínas da camada superficial (SLPs))^{12,13 , 14 , 15}. estas observações têm estimulado o desenvolvimento da primeira imunoterapia passiva droga alvo c. difficile toxina B (bezlotuxumab), que recentemente foi aprovado pelo Food e Drug Administration e os medicamentos Europeu Agência para a prevenção da recorrente CDI¹⁶. Estratégias de vacinação usando toxinas inactivadas ou fragmentos de toxina recombinante também estão atualmente sob desenvolvimento^17,18,19. Estas novas abordagens terapêuticas, sem dúvida, irão estimular a exigência de avaliação humorais respostas imunes aos antígenos múltiplos em tamanhos de amostra grande.

Hoje, há uma notável falta de ensaios comercialmente disponíveis de alta produtividade capaz de avaliar simultaneamente a estirpe bacteriana e respostas específicas do isotipo do anticorpo aos antígenos de c. difficile . Há uma necessidade não atendida de desenvolver tais ensaios para facilitar os esforços de investigação futuras e aplicações clínicas. Os microarrays da proteína são um método para imobilizar um grande número de proteínas purificadas individualmente como uma matriz espacialmente organizada de pontos sobre uma superfície com base em slide microscópica por meio de um sistema robótico, que pode ser um contato²⁰ ou um contato não- ²¹. ferramenta da impressão. As manchas podem representar misturas complexas como lisados celulares, anticorpos, tecido homogenates, proteínas endógenas ou recombinantes ou peptídeos, fluidos corporais ou drogas^22,23.

Tecnologia de microarray de proteína oferece vantagens distintas sobre ELISA in-house padrão técnicas, que tem sido tradicionalmente usadas para avaliar as respostas de anticorpos dec. difficile anti. Estes incluem um aumento da capacidade para a detecção de uma gama de multi-específicas do isotipo anticorpos contra um painel mais amplo de alvos de proteína, requisitos de volume reduzido de antígenos, amostras e reagentes e a capacidade avançada de incorporar uma maior número de repetições de técnicas, além de controle de qualidade interno múltiplo (QC) mede¹. Microarrays são, portanto, mais sensíveis, precisos e reprodutíveis e têm uma maior gama dinâmica. Esses fatores tornam microarrays uma alternativa mais barata e potencialmente favorável para ELISA para a detecção em larga escala de proteínas conhecidas. No entanto, as desvantagens da tecnologia microarray resultam principalmente os grandes custos adiantados associados com o estabelecimento de um painel de antígenos altamente purificados e criação de plataforma tecnológica.

Os microarrays da proteína têm sido extensivamente usados nas últimas duas décadas como ferramenta de pesquisa básica e diagnóstico em aplicações clínicas. Aplicações específicas incluem a expressão da proteína de perfil, o estudo das relações de enzima-substrato, triagem de biomarcador, análise das interações do anfitrião-micróbio e criação de perfil de anticorpo especificidade^{23,24, 25}de^27,,26,28. Muitos novo patógeno/antígeno da proteína microarrays foram estabelecidos, incluindo malária (Plasmodium)²⁹, HIV-1³⁰, gripe³¹, síndrome respiratória aguda grave (SARS)³², febre hemorrágica viral³³ , herpesviruses,³⁴e tuberculose³⁵.

O presente protocolo refere-se ao estabelecimento de um fácil funcionamento C. difficile antígeno reativa microarray do ensaio, que permite a quantificação, precisa e específica de multi-isotype e respostas de anticorpos específicos de estirpe de C. difficile antígenos em soros e policlonal IVIg. Neste documento, que incluem resultados representativos referentes a um desempenho aceitável do microarray quando comparado com ELISA, bem como a precisão do ensaio e a reprodutibilidade perfis. Este ensaio poderia ser desenvolvido para o perfil de outras amostras clínicas e define um novo padrão para a investigação sobre a base molecular do CDI.

Protocol

1. preparar um prato de Microarray Diluir a antígenos de c. difficile com um buffer de impressão [PBS-Tween-trealose (50mm)] para a concentração ideal (que foi predefinida antes de executar o paciente sera): toxina um (200 µ g/mL) e toxina B (100 µ g/mL), pCDTb (200 µ g/mL) e purificado nativo SLPs todo derivado ribotypes 001, 002 e 027 (200 µ g/mL).Nota: Toxina B foi obtida uma toxina B-expressando estirpe CCUG 20309 (90 µ g/mL). Dilua os controles positivos, lysates de c. alb…

Representative Results

A Figura 1 ilustra um fluxograma descrevendo as etapas principais no protocolo descrito. A Figura 2 mostra testes de correlação de Spearman demonstrando acordo significativo entre microarray e ELISA IgG e IgA antitoxina A e B os níveis no paciente teste sera. A Figura 3 mostra diferencial IgG e IgA de anticorpo-classe respostas de anticorpos específicos para A toxina, toxina B e toxina binária (…

Discussion

Neste protocolo, mostramos que microarray é uma plataforma adequada para definir humorais respostas imunes aos antígenos de proteína c. difficile em soros de doentes (figuras 3 e 6) e preparações comerciais de IVIg (Figura 5). Nós também têm demonstrado que a técnica de microarray executa bem em comparação com o ELISA convencional (Figura 2) e mostra excelente reprodutibilidade, com intra e inter assay variab…

Materials

BioRobotics MicroGrid II arrayer	Digilab, Malborough, MA, USA	N/A	Contact arrayer used to automated spotting of the antigens onto the slides.
Scanner InnoScan 710.	Innopsys	N/A	A fluorescent microarray slide scanner with a red (Cy5) laser to read the reaction.
MAPIX software version 7.2.0	Innopsys	N/A	Measure signal intensities of the spots.
Silicon contact pin	Parallel Synthesis Technologies	SMT-P75	Print the samples onto the slides.
Thermo Scientific Nalgene Desiccator	Thermo Scientific	41102426	To store the new and printed slides.
384-well plate	Genetix	X7022UN	To prepare the antigens.
Plate cover	Sigma Aldrich, UK	CLS6570-100EA	To reduce evaporation of the samples.
Aminosilane slides	Schott,  Germany	1064875	The slide of choice for printing the antigens.
Slide holders	GraceBio Labs, USA	204862	Divide the slides into identical 16 subarrays. These holders are re-usable, removable, leak-proof wells .
Candida albicans lysate	NIBSC	PR-BA117-S	Positive control
Tetanus Toxoid	Athens Research and Technology	04/150	Positive control
Immunoglobulin G (IgG), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707	Purified Native Human Immunoglobulin G IgG, Human Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-1	Purified Native Human Immunoglobulin G1 IgG1, Human Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-2	Purified Native Human Immunoglobulin G2 IgG2, Human Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-3	Purified Native Human Immunoglobulin G3 IgG3, Human Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normal Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090707-4	Purified Native Human Immunoglobulin G4 IgG4, Human Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701	Purified Native Human Immunoglobulin A (IgA), Human Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-1M	Purified Native Human Immunoglobulin A1 (IgA1), Human Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Myeloma Plasma	Athens research and  technology	16-16-090701-2M	Purified Native Human Immunoglobulin A2 (IgA2), Human Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma	Athens research and  technology	16-16-090713	Purified Native Human Immunoglobulin M (IgM), Human Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma chain specific	Vector Labs	BA-3080	Goat anti- human IgG (γ-chain specific)-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG1 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9052-08	Goat anti- human IgG1 biotin antibody reacts specifically with human IgG1 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG2 Fc-BIOT	Southern Biotec	9060-08	Goat anti- human IgG2 -biotin antibody reacts specifically with human IgG 2but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG3 Hinge-BIOT	Southern Biotec	9210-08	Goat anti- human IgG3-biotin antibody reacts specifically with human IgG3 but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgG4 pFc'-BIOT	Southern Biotec	9190-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Anti-Human IgA, alpha chain specific, made in goat – Biotinylated	Vector Labs	BA-3030	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA1-BIOT	Southern Biotec	9130-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgA2-BIOT	Southern Biotec	9140-08	Goat anti- human IgG -biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
Mouse Anti-Human IgM-BIOT	Southern Biotec	9020-08	Goat anti- human IgG-biotin antibody reacts specifically with human IgG but not with other immunoglobulins.
0.2 mm syringe filter	Thermo scientific	723-2520	Filter the 5% BSA.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich, UK	A7284	Use 5% BSA for blocking the slides.
Antibody diluent	Dako, UK	S3022	To dilute the serum and the secondary antibody.
Streptavidin Cy5	eBioscience	SA1011	Detection of the immune reaction.
Purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087)	Toxins Group, Public Health England	NA
Purified whole C. difficile toxin B (CCUG 20309 toxin B only expressing strain)	Toxins Group, Public Health England	NA
Precursor form of B fragment of binary toxin, pCDTb	University of Bath	NA	Produced in E. Coli from wholly synthetic recombinant gene construct. Amino acid sequence based on published sequence from 027 ribotype (http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70)
Purified native whole ribotype-specific (001, 002, 027) surface layer proteins	Dublin City University	NA
Vigam (IVIg preparation 1)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Privigen (IVIg preparation 2)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A
Intratect (IVIg preparation 3)	Nottingham University Hospitals NHS Trust	N/A