Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Summary

Мы представляем простой и надежный протокол для измерения содержания железа в тканях растений, с помощью метода колориметрические лазурь.

Abstract

Железо, один из самых важных микроэлементов в живых организмов, участвует в основных процессов, таких как дыхания и фотосинтеза. Содержание железа является довольно низким во всех организмах, равнозначно примерно 0,009% от сухого веса в растениях. На сегодняшний день, один из наиболее точных методов для измерения концентрации железа в тканях растений является пламя атомной абсорбционной спектроскопии. Однако этот подход является длительным и дорогостоящим и требует специального оборудования, не встречаются в лабораториях завода. Поэтому необходима более простой, но точный метод, который может использоваться регулярно. Колориметрический метод лазурь регулярно используется для качественного железа, пятнать в гистологических срезах животных и растений. В этом исследовании мы адаптировали лазурь, метод для количественных измерений железа в табачных листьев. Мы проверить точность этого метода, с помощью атомной спектроскопии и лазурь пятнать измерить содержание железа в том же образцах и нашли линейной регрессии (R² = 0.988) между этими двумя процедурами. Мы заключаем, что метод лазурь для измерения количественных железа в тканях растений точный, простой и недорогой. Однако линейной регрессии, представленные здесь могут не подходить для других видов растений, из-за потенциального взаимодействия между образцом и реагент. Создание кривой регрессии таким образом необходима для различных видов растений.

Introduction

Железо (Fe) является важным микроэлементов во всех живых организмах. В растениях это важнейших микроэлементов¹ из-за его участия в основных процессов, таких как биосинтеза хлорофилла, дыхание и фотосинтез. Высокое накопление ионов свободного железа вредно для растительных клеток за счет реакции, ведущие к освобождению свободных радикалов, вызывая оксидативного стресса. Для поддержания гомеостаза железа в растительной клетке, ионы хранятся в вакуоли и поглощенных внутри ferritins, белок клеток, непосредственно участвующих в Железный гомеостаза² и структуры основного хранения железа во всех живых организмах. В то же время железо дефицитной анемии затрагивает значительную долю населения, привело растущую потребность растений рекомендовавшая Fe. Благодаря уникальным свойствам растений ферритина обогащение пищи с ферритина железом предлагает перспективные стратегии для борьбы с этой проблемой недоедания³.

Ионы железа, главным образом в двух окисления, а именно черных (двухвалентной Fe^{2 +} или железа (II)) и железа (Fe трехвалентного^{3 +} или железа (III)) формы. Несколько других форм железа, например кластеров железа⁴, также находятся в клетках. FE хранится в виде оксида железа в клетки и естественно форм hematites (Fe₂O₃) и ferryhidrites ((Fe)^{3 +}₂O₃•0.5 H₂O) при физиологических условиях⁵. Гидроксиды, сформированные в этих реакциях, особенно железа форме, имеют очень низкую растворимость. Удержание железа поэтому зависит от рН раствора и в значительной степени в твердом состоянии выше рН 5-⁶.

Учитывая плохая растворимость и высокая реакционная способность Fe ее передачи среди растительных тканей и органов должен быть связан с подходящим хелатирующий молекул. Кроме того необходимо контролировать его редокс государств между черной и железа формы¹ . В листьях около 80% железа находится в фотосинтезирующих клеток, из-за ее существенную роль в транспортная система электронов, в биосинтезе цитохромов, хлорофилл и других молекул гема и в формировании Fe-S⁷кластеров. В случае железа избыток в ячейке излишек является перемещен в вакуоль, где Металл хранится в ферритина молекул⁸.

Железо может измеряться в тканях растений на несколько методов, включая пламени атомной абсорбционной спектроскопии⁹ (ФААС) или колориметрический анализов¹⁰, бывший, будучи гораздо более точным, чем последний. ФААС это очень точная техника, которая позволяет одному определить химический состав выборки на основе электромагнитного излучения отдельных элементов. ФААС преобразует ионов металлов в атомной государствам, пламя Отопление образца, привело к Ион возбуждения и выбросов определенной длины волны, когда данный Ион возвращается в состояние земли. Выбросы из различных ионов разделенных монохроматора и обнаружен датчик поглощения¹¹. ФААС таким образом служит для непосредственно количественного определения концентрации железа. Другие методы для визуализации железа в биологических тканях доступны, однако. Индуктивно связанная плазма масс-спектрометрия (ИСП-МС)¹² является очень точный метод измерения железа и других микроэлементов, но отсутствие оборудования, как для ФААС и ИСП-МС, является общей проблемой. С другой стороны измерения железа тиоцианат колориметрии¹³ недостает точности и не удается обнаружить небольшие вариации между выборками. Прусский синий окрашивание^,14,,151617 это косвенный метод, основанный на реакции железа Ферроцианид калия (K₄Fe(CN)₆) с катионов Fe, производство сильный синий цвет и используется для обнаружения качественной железа в гистологических срезах тканей животных и растений.

Металлические (нулевой Валент) железо является редким в литосфере. Доминирующей не complexed ионной форме железа в окружающей среде основном диктуется количество кислорода в окрестностях, с будучи относительно более обильные в анаэробной среде черных и железа чугуна, преобладающая в аэробных сайтов. Эта последняя форма также является доминирующей в крайне-кислых средах, хотя возбудители черных железа окисления часто отличаются в анаэробных и кислой окрестности¹⁸. Когда железа солюбилизирован в 4% HCl (рН 0) в аэробных условиях, большая часть разреженных железа существует как железа (Fe)^{3 +19,20}.

Реакции между ионами Fe и K₄Fe(CN)₆ являются следующие:

FE^{3 +}: FeCl K₄Fe(CN)₆ +₃ = KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl

FE^{2 +}: 4 FeCl₂ + 2 K₄Fe(CN)₆ =₄(Fe(CN)₆) Fe₂ + 8 KCl

В настоящем исследовании мы спросили ли Прусский голубой окраски может быть полезен для измерения уровня железа в растворе.

Первоначально мы проверили корреляции между концентрацией Fe в водном растворе и прусского синего окрашивания. Концентрация в водных растворах Fe (как FeCl₂, FeCl₃ или 1:1 смесь двух) был измерен атомной спектроскопии и поглощения (OD) после добавления лазурь. Рисунок 1 показывает кривые линейной регрессии для измерений, полученных каждым методом. Мы пришли к выводу, что Прусский синий метод может использоваться для количественного анализа концентрации железа в растворе.

Рисунок 1: линейной регрессии между Fe концентрация измеряется ФААС и поглощения света (OD, 715 Нм) получены методом Прусский синий. Синие квадраты и линии представляют собой Fe^{2 +} решение, красные квадраты и линии представляют собой решение^{3 +} Fe и черные квадраты и линии представляют собой смесь 1:1 между Fe^{2 +} и Fe^{3 +}. Были получены следующие регрессии: [Fe^{2 +}] = 3 + 123 x ОД, r = 0.996, R² = 0.989; [Fe^{3 +}] = 1 + 292 x ОД, r = 0,999, R² = 0,997; и [Fe^{2 +/ 3 +}] = 11 + 146 x ОД, r = 0.983, R² = 0.956. Fe^{2 +} доноров был FeCl₂ и Fe^{3 +} доноров был FeCl₃. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Адаптировать колориметрические Прусский синий метод для анализа количественных железа растительных тканей, содержание железа табачных листьев пепел был измерен пламени атомной абсорбционной спектроскопии и Прусский синий окрашивания. Там была хорошая корреляция между результаты из двух методов.

Protocol

1. завод материал и условия роста Семян один табака (сорт Самсун) семян на 5 х 5 см горшок заполнены среднего стандарта горшок. Поместите горшки на поддоны. Растут растения в комнате роста в условиях насыщенного дня (16/8 h свет/темно) при постоянной температуре 23 ° c. Орошения с водопрово…

Representative Results

Когда этот протокол осуществляется правильно, один должен получить отличную корреляцию между результаты, полученные методами Прусский синий и атомной спектроскопии. Таким образом метод Прусский синий может легко использоваться для получения точного измерения конц?…

Discussion

Измерения железа в тканях растений очень важно для оценки влияния орошения или других экологических условий. Здесь мы описали, легкой и точной колориметрический метод для Fe содержимого измерения в табачных листьев, которые могут быть легко адаптированы для других видов растений и тка?…

Materials

Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.