Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Summary

Wij presenteren een eenvoudige en betrouwbare protocol voor het meten van ijzergehalte in plantaardige weefsels met behulp van de colorimetrische Pruisisch blauw-methode.

Abstract

Ijzer, één van de meest belangrijke micronutriënten in levende organismen, is betrokken bij basic processen, zoals ademhaling en fotosynthese. Ijzergehalte is vrij laag in alle organismen, ten bedrage van in planten ongeveer 0.009% van het drooggewicht. Tot op heden, is een van de meest nauwkeurige methoden voor het meten van de concentratie van het ijzer in plantaardige weefsels vlam atomaire absorptie spectroscopie. Echter, deze aanpak is tijdrovend en duur en vereist specifieke apparatuur niet vaak gevonden in de laboratoria van de plant. Dus is een eenvoudiger, maar nauwkeurige methode die kan worden routinematig gebruikt nodig. De colorimetrische Pruisisch blauw-methode wordt regelmatig gebruikt voor kwalitatieve ijzer kleuring in dier- en plantensoorten histologische secties. In deze studie aangepast we de Pruisisch blauw methode voor kwantitatieve metingen van ijzer in tabak verlaat. Wij gevalideerde de nauwkeurigheid van deze methode met behulp van zowel atomaire spectroscopie en Pruisisch blauw kleuring gevonden van een lineaire regressie te meten ijzergehalte in de dezelfde monsters (R² = 0.988) tussen de twee procedures. We concluderen dat de Pruisisch blauw-methode voor meting van de kwantitatieve ijzer in plantaardige weefsels nauwkeurige, eenvoudige en goedkope. De lineaire regressie hier gepresenteerd kan echter niet dienstig voor andere plantensoorten, als gevolg van mogelijke interacties tussen het monster en reagens. Oprichting van een regressie-curve is dus nodig voor verschillende plantensoorten.

Introduction

Ijzer (Fe) is een belangrijke micronutriënt in alle levende organismen. In planten is het een essentiële micronutriënt¹ vanwege zijn betrokkenheid bij fundamentele processen, zoals ademhaling, fotosynthese en chlorofyl biosynthese. Hoge accumulatie van vrij ijzer ionen is schadelijk voor de plantaardige cellen als gevolg van reacties leidt tot het vrijkomen van vrije radicalen veroorzaakt oxidatieve stress. U behoudt ijzer homeostase binnen de plant cel, zijn ionen opgeslagen in de vacuolen en afgezonderd binnen ferritins, eiwit kooien rechtstreeks betrokken is bij iron homeostase² en de opslagstructuur van de belangrijkste van ijzer in alle levende organismen. Ijzertekort bloedarmoede beïnvloedt tegelijkertijd, een aanzienlijk deel van de menselijke bevolking, wat resulteert in een toenemende behoefte aan plant Fe biofortification. Als gevolg van de unieke eigenschappen van de plant Ferritine biedt voedsel verrijking met Ferritine-strijkijzer een veelbelovende strategie ter bestrijding van dit probleem van ondervoeding³.

Ijzer ionen zijn voornamelijk gevonden in twee oxidatie Staten, namelijk de Ferro (divalente Fe^{2 +} of ijzer (II)) en ijzer(III) (driewaardig Fe^{3 +} of ijzer (III)) vormen. Verschillende andere vormen van ijzer, zoals ijzer clusters⁴, zijn ook gevonden in de cellen. Fe wordt opgeslagen als ijzeroxide binnen de cel en natuurlijk vormen hematites (Fe₂O₃) en ferryhidrites ((Fe^{3 +})₂O₃•0.5 H₂O) onder fysiologische omstandigheden⁵. De hydroxiden gevormd bij deze reacties wordt vooral de ijzer(III) vorm, hebben zeer lage oplosbaarheid. IJzeren retentie wordt dus beïnvloed door de pH van de oplossing en is grotendeels in een vaste toestand boven pH 5-⁶.

Gezien de slechte oplosbaarheid en hoge reactiviteit van Fe, moet haar overdracht tussen plantaardige weefsels en organen gepaard gaan met geschikte chelaatvormers moleculen. Bovendien moeten haar redox-Staten tussen de ferro- en ijzer(III) vormen¹ worden gecontroleerd. Binnen bladeren, ongeveer 80% van het ijzer is gevonden in de fotosynthetische cellen, vanwege haar essentiële rol in het elektronentransport systeem, in de biosynthese van de cytochromes, chlorofyl en andere Heem moleculen, en bij de vorming van Fe-S clusters⁷. In het geval van ijzer overtollige binnen de cel, wordt het overschot in de vacuole waar het metaal wordt opgeslagen in de Ferritine moleculen⁸translocated.

Ijzer kan worden gemeten in plantaardige weefsels door verschillende methoden, inclusief vlam atomaire absorptie spectroscopie⁹ (FAAS) of colorimetrische testen¹⁰, de voormalige wordt veel nauwkeuriger dan de laatste. FAAS is een zeer nauwkeurige techniek waarmee een te bepalen van de elementaire samenstelling van een monster op grond van de elektromagnetische emissie van de afzonderlijke elementen. FAAS omgezet in metaalionen atomaire Staten door vlam-verwarming van het monster, wat leidt tot ion excitatie en emissie van een specifieke golflengte wanneer een bepaalde ion naar de grondtoestand terugkeert. De emissies van de verschillende ionen zijn gescheiden door een monochromator en gedetecteerd door een absorptie sensor¹¹. FAAS dient dus te kwantificeren direct concentraties ijzer. Andere technieken voor het visualiseren van ijzer in biologische weefsels zijn echter beschikbaar. Inductief gekoppeld plasma-mass spectroscopie (ICP-MS)¹² is een zeer exacte techniek voor het meten van ijzer en andere sporenelementen, maar het gebrek aan apparatuur, zowel voor FAAS en ICP-MS, is een veelvoorkomend probleem. Aan de andere kant, meting van de ijzer door kaliumthiocyanaat colorimetrie¹³ ontbreekt precisie en kleine verschillen tussen monsters herkent. Pruisisch blauw kleuring van^14,15,16,17 is een indirecte methode op basis van de reactie van ijzer(III) kaliumferrocyanide (K₄van Fe(CN)₆) met Fe kationen, produceren een sterke blauwe kleur, en wordt gebruikt voor de detectie van de kwalitatieve ijzer in histologische secties van dierlijke en plantaardige weefsels.

Metalen (nul-valent) ijzer is zeldzaam in de lithosfeer. De dominante niet-complexvorm Ionische vorm van ijzer in het milieu is het meestal ingegeven door de hoeveelheid zuurstof in de omgeving, met Ferro ijzer wordt relatief meer overvloedig in zuurstofvrije omgevingen en ijzer(III) ijzer overheersen in aërobe sites. Deze laatste vorm is ook dominant in een zeer zure omgeving, hoewel het oorzakelijke agens van oxidatie van ijzer ijzer vaak in zuurstofvrije en zure omgeving^{18 verschillen}. Wanneer ijzer is ontbindend in 4% HCl (pH = 0) in een aërobe omgeving, het grootste deel van het verdunde ijzer bestaat zoals de ijzer(III) (Fe^{3 +})^{19,20 vormen}.

De reacties tussen Fe ionen en K₄Fe(CN)₆ zijn als volgt:

Fe^{3 +}: FeCl₃ + K₄Fe(CN)₆ KFe(III)Fe(II)(CN)₆¯ + 3KCl =

Fe^{2 +}: 4 FeCl₂ + 2 K₄Fe(CN)₆ = Fe₄(Fe(CN)₆)₂ + 8 KCl

In de huidige studie vroegen we of Pruisisch blauw kleuring kunnen nuttig zijn voor het meten van de niveaus van het ijzer in oplossing.

Aanvankelijk, gecontroleerd we de correlatie tussen de concentratie van Fe in waterige oplossing en Pruisisch blauw kleuring. De Fe (als FeCl₂, FeCl₃ of een mengsel van 1:1 van de twee) concentratie in waterige oplossingen werd zowel door atomaire spectroscopie extinctie (OD) gemeten na toevoeging van Pruisisch blauw. Figuur 1 toont de curven van de lineaire regressie voor metingen verkregen door elke methode. Wij geconcludeerd dat de Pruisisch blauw methode kan worden gebruikt voor de kwantitatieve analyse van ijzer-concentratie in de oplossing.

Figuur 1: lineaire regressies tussen Fe concentratie gemeten door FAAS en lichtabsorptie (OD, 715 nm) verkregen door de Pruisische blauwe methode. De blauwe vierkantjes en de lijn vertegenwoordigen de Fe^{2 +} oplossing, de rode vierkantjes en de lijn vertegenwoordigen de Fe^{3 +} oplossing en de zwarte vierkantjes en lijn vertegenwoordigen een 1:1-mengsel tussen Fe^{2 +} en Fe^{3 +}. De volgende regressies werden verkregen: [Fe^{2 +}] = 3 + 123 x OD, r = 0.996, R² = 0.989; [Fe^{3 +}] = 1 + 292 x OD, r = 0.999, R² = 0.997; en [Fe^{2 +/ 3 +}] = 11 + 146 x OD, r = 0.983, R² = 0.956. De Fe^{2 +} donor was FeCl₂ en de Fe^{3 +} donor was FeCl₃. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aan te passen de colorimetrische Pruisisch blauw methode voor kwantitatieve ijzer analyse van plantaardige weefsels, werd het ijzergehalte van tabak blad as gemeten door vlam atomaire absorptie spectroscopie en Pruisisch blauw kleuring. Er werd een goede correlatie tussen de resultaten van door de twee technieken.

Protocol

1. plant materiaal en groei-omstandigheden Zaad één tabak (cultivar Samsun) zaad per 5 cm x 5 cm pot gevuld met standaard pot medium. Plaats de potten op laden. De planten groeien in een groei ruimte onder de voorwaarden van de lange dag (16/8 h licht/donker) bij een constante temperatuur van 23 ° C. Irrigeren met leidingwater tot water afvoerleidingen van de pot. Na 50±5 dagen, Fe behandelingen in de irrigatie, volgens de concentraties die geschikt zijn voor het experiment te beginnen. Bijvoorbee…

Representative Results

Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, moet een uitstekende correlatie tussen de resultaten van de Pruisisch blauw en atomaire spectroscopie methoden krijgen. Daarom kan de Pruisisch blauw methode gemakkelijk worden gebruikt om een nauwkeurige meting van de ijzer-concentratie in de monsters van de plant, zoals blijkt uit het volgende experiment. Tabaksplanten waren gegroeid zoals beschreven in het protocol en geïrrigeer…

Discussion

Meting van de ijzer in plantaardige weefsels is zeer belangrijk voor de evaluatie van de effecten van irrigatie of andere omgevingsfactoren. We beschreven hier, een gemakkelijke en nauwkeurige colorimetrische methode voor Fe inhoud metingen in tabaksbladeren, die gemakkelijk aangepast aan andere plantensoorten en weefsels worden kan.

In het optimaliseren van voorwaarden voor de colorimetrische methode, gebruikten we een lage pH-medium (pH < 1.0) dat ijzer oplosbaarheid. Het brandproces werd ui…

Materials

Potassium Hexacyanoferrate(II)	Fisher Chemical	14459-95-1	Reagent for the Pussian Blue
Millex Syringe Filter Unit, Vial Vent 0.22 μm	Millec	SLGP033RS	Filter used to filter the ashes + 4% HCl Solution
Scintillation Vials	Fisherbrand	03-337-4	Used to keep the dry powdered plant material during the burning procedure.
Disposable Syringe 10 ml	Medi-Plus	1931	Syringe used during the filtration
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	231-595-7	Used in the 4% HCl solution to dilute the ashes and clean the materials
Tobacco, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN	Obtained from Prof. Simon Barak and routinely used in the Zaccai Lab	Barak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of the glycolate oxidase gene in tobacco seedlings. Plant Molecular Biology. 2001 Mar 1;45(4):399-407.	Tobacco cultivar used in this protocol
Glass Wool (Rock Wool)	Sigma-Aldrich	659997-17-3	Used in the procedure of burning samples in the furnace.