כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה
Summary
כל המינים לישמניה פתוגניים שוכנים וישכפלו בתוך המקרופאגים של מארחיהם חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדביק מאתר מקרופאגים הנגזרות מח עצם בתרבות עם לישמניה, ואחריו כימות מדויק של קינטיקה גידול תאיים. שיטה זו שימושית עבור לימוד בודדים הגורמים המשפיעים על אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, לישמניה התקפה אלימה.
Abstract
מחזור החיים של לישמניה, סוכן סיבתי של שושנת יריחו, נחליף בין שלבים promastigote, amastigote פנימה החרק ומארח חוליות, בהתאמה. בעוד תסמינים פתוגניים של שושנת יריחו, יכולה להשתנות מ שפיר נגעים עורית לטפסים מחלה קטלנית מאוד מהבטן תלוי בזן זיהומיות, כל המינים לישמניה שוכנים בתוך המקרופאגים מארח במהלך שלב חוליות מחזור החיים שלהם. לישמניה infectivity ולכן קשורה ישירות את יכולתו לפלוש, לשרוד, לשכפל בתוך וקואלות parasitophorous (PVs) בתוך המקרופאגים. לפיכך, הערכת היכולת של הטפיל לשכפל intracellularly מגישה כשיטה אמין לקביעת התקפה אלימה. לימוד פיתוח שושנת יריחו באמצעות מודלים בעלי חיים היא גוזלת זמן, מייגע, לעתים קרובות קשה, במיוחד עם הטפסים הקרביים pathogenically חשוב. נתאר כאן מתודולוגיה לעקוב אחר התפתחות תאיים לישמניה ב מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs). טפיל תאיים מספרים נקבעים במרווחי 24 שעות ביממה עבור h 72-96, בעקבות זיהום. שיטה זו מאפשרת נחישות אמין של ההשפעות של גורמים גנטיים שונים על לישמניה התקפה אלימה. לדוגמה, אנו מציגים כיצד אלל יחיד מחיקה של הגן לישמניה מיטוכונדריאלי ברזל טרנספורטר (LMIT1) וביכולתם של המתח מוטציה לישמניה amazonensis LMIT1/ΔLmit1 לגדול בתוך BMMs, המשקפים ירידה דרסטית התקפה אלימה לעומת פראי-סוג. Assay הזה גם מאפשר שליטה מדויקת על תנאי הניסוי, אשר ניתן לטפל בנפרד כדי לנתח את השפעת גורמים שונים (חומרים מזינים, מינים חמצן תגובתי, וכו ‘.) על האינטראקציה פתוגן-פונדקאי. לכן, ביצוע המתאימה ואת כימות של מחקרים זיהום BMM לספק חלופה לא פולשנית, מהיר, חסכוני, בטוחה ואמינה ללימודים במודל חיה קונבנציונלי.
Introduction
שושנת יריחו מתייחס לקשת רחבה של מחלות האדם הנגרמת על ידי טפילים protozoan מינים של הסוג לישמניה. כ- 12 מיליון אנשים נגועים כרגע לישמניה ברחבי העולם, בלמעלה מ-350 מליון נמצאות בסיכון. המחלה פתולוגיה תלוי על מינים לישמניה מארח הגורמים, הסימפטומים משתנים בין נגעים בעור ריפוי עצמי לא מזיק לטפסים visceralizing קטלני. אם אינה מטופלת כראוי, מהבטן לישמניה קטלנית, הדירוג רק לאחר מלריה כמו המחלה האנושית הקטלני ביותר הנגרמת על ידי זיהום עם טפילים protozoan1. למרות ההבדלים למחשוב המחלה פתולוגיה ותסמינים, כל המינים לישמניה יש digenic-מחזור חיים לסירוגין בין promastigote ו amastigote שלבים בתוך חרק מארחים חוליות, בהתאמה. בתוך החוליות, לישמניה המטרה המארח מקרופאגים לפלישה, לגרום להיווצרות וקואלות parasitophorous (PVs), תאי חומצי עם המאפיינים של phagolysosomes שבו לשכפל הטפסים amastigote מאוד מידבק. Amastigotes נמשכות ברקמות מארח במהלך זיהומים כרוניים, ניתן להעביר זבובי־חול מצפים נגוע, להשלמת המעגל שידור. לכן, בהקשר של התפתחות מחלות אנושיות, amastigotes הם החשובים ביותר לישמניה מחזור טופס2. חוקר איך לשכפל את amastigotes בתוך מקרופאג PVs הוא קריטי עבור הבנה לישמניה התקפה אלימה3,4,5,6,7 ועבור פיתוח טיפולים חדשניים אפקטיבי.
נתאר כאן שיטה המשמשת באופן קבוע על ידי מעבדה שלנו ללמוד דלקת לישמניה ושכפול של מקרופאגים הנגזרות מח העצם (BMMs), אשר כוללת הערכה כמותית של מספר תאיים לישמניה לאורך זמן. התהליך כרוך קצירת ומונוציטים מ מח עצם העכבר ובידול מקרופאגים בתרבות, זיהום במבחנה עם צורות זיהומיות (metacyclic promastigotes או amastigotes) של לישמניה , כימות מספר תאיים טפילים-בכל פרק זמן של 24 שעות ביממה לתקופה של 72-96 שעות בעקבות זיהום. נעשה שימוש assay הזה במעבדה שלנו כדי לקבוע את ההשפעה של מספר גורמים סביבתיים, טפיל גנים, כולל זיהוי של תפקיד קריטי של ברזל בקידום התקפה אלימה ל’ amazonensis היה עוד יותר לאימות על ידי לו טביעות רגל לימודי התפתחות הנגע עכברים6,8,9,10,11,12,13,14,15 . מאז כל המינים לישמניה פתוגניים לבסס את הנישה replicative שלהם בתוך המארח מקרופאגים, וזמינותו הזה יכול לשמש אוניברסלית האישושים התקפה אלימה על כל המינים לישמניה .
ביצוע BMM זיהומים מאפשר ניתוח אינטראקציות מארח-טפיל ברמה תא בודד, ובכך הבנה רחבה יותר של מה טפילים לישמניה לקיים אינטראקציה עם microenvironment מארח המועדפת שלהם, PVs של מקרופאגים. מקרופאג זיהום מבחני בהצלחה שנוצלו על ידי מספר קבוצות16,17,18,19,20,21,22 לחקור פונקציות הן מקרופאג מארח את גנים ספציפיים לישמניה , ואת מעורבותם פוטנציאליים הגומלין המורכבים המאפיינת את זיהום תאיים. זיהומים BMM לאפשר כימות של צמיחה טפיל כמו read-out ההשפעה של המארח גורמים המשפיעים על ההישרדות תאיים, כגון ייצור תחמוצת החנקן microbicidal, דור של מינים חמצן תגובתי, התנאים לוואי אחרים המערכת נתקלה בפנים PVs ליזוזום דמוי23. מקרופאג זיהום מבחני גם כבר מנוצל כדי לזהות הפניות סמים אנטי-leishmanial פוטנציאליים עבור פיתוח טיפולית13,24.
הטבע במבחנה של זיהומים BMM מספקת מספר יתרונות על פני שיטות אחרות כדי להעריך לישמניה התקפה אלימה. עם זאת, מספר מחקרים קודמים בחינת מנגנונים תאיים טפילים לשרוד לאורך זמן לא לכמת זיהום כמו בגודל21,20,קצב24. יתר על כן, מחקרים רבים התמקדו בעקבות זיהומים ויוו לאורך זמן עשו זאת על ידי מדידת גודל הנגע עורית וסימפטומים פיסיולוגיים אחרים הקשורים רק בעקיפין טפיל שכפול25,26 , 27. in vivo זיהום היא גישה מחמירה כדי להעריך את הטפיל התקפה אלימה, אבל מדידות גודל הנגע על סמך לו טביעות רגל ונפיחות לבדו לעיתים לקוי, כפי הם משקפים את התגובה דלקתיים ברקמות נגוע ולא המספר המוחלט של טפילים. מסיבה זו, התפתחות הנגע לו טביעות רגל מבחני חייבת להיות מלווה כימות של עומס הטפיל ברקמות נגוע, תהליך שדורש דילול המגביל ממושך מבחני28. בנוסף, מחקרים ויוו לעתים קרובות כרוך הקרבת בעלי חיים מרובים בנקודות שונות בזמן כדי לחלץ לרקמות של הריבית6,8,9,10, 11 , 13. לעומת זאת, ניתן להשיג מספר רב של BMMs חיה אחת, תאים אלה יכול להיות מצופה בתנאים לאפשר הערכה של זיהום בנקודות שונות בזמן. יתר על כן, בהשוואה ל ויוו מחקרים, ביצוע במבחנה BMM זיהומים מאפשר שליטה רבה יותר על תנאי הניסוי. לכימות של מקרופאגים להידבק יחד עם טפילים עצמם מאפשר שליטה מדויקת של הריבוי של זיהום (MOI) ושל תרבות תנאים. שליטה טובה על גורמים אלה יכולים להיות מפתח לזיהוי מאפייני דיסקרטית מסלולים סלולר, להבין את השפעתם על מהלך של זיהום.
לאור יתרונות אלו, זה די מפתיע כי מעט מאוד קבוצות לימוד לישמניה התקפה אלימה כה מנצלים מלא הערכה כמותית של שכפול תאיים ב מקרופאגים. במאמר זה נדון מלכודות נפוצות עשוי להיות פוגעות ניצול נרחב יותר של זה וזמינותו, ומספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כדי להקל על ביצועה נאות. בהתחשב הדיוק שלה ואת צדדיות, וזמינותו זיהום BMM שנתאר כאן יכול לא רק להיות מנוצל כדי לחקור את האינטראקציות פתוגן-פונדקאי המשפיעים על התקפה אלימה לישמניה , אלא גם ללמוד אחרים המיקרואורגניזמים לשכפל בתוך מקרופאגים29. חשוב, זה וזמינותו יכולים גם להתפתח כשיטת הקרנת טרום קליניים מהיר וחסכוני עבור פיתוח תרופות אנטי-leishmanial.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנתונים הכמותיים המיוצר על ידי זיהום BMM וזמינותו שתוארה לעיל, מאפשר חוקרים כדי להשיג את המחירים של זיהום ונחישות אמין של שינויים במאפייני התקפה אלימה בתוך פרק זמן קצר יחסית (מקסימום 2 שבועות, בהשוואה ל- 2 חודשים הדרושים לניסויים ויוו ). שיטה זו מתבססת על ה-DNA ספציפיים לצבוע דאפי, במיוחד כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק RO1 AI067979 NWA.
YK היא זוכת מלגת תואר ראשון מ הווארד יוז המכון/האוניברסיטה הרפואית של מרילנד קולג פארק.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
