대 식 세포 안의 세포내 성장의 정량화는 빠르고 Leishmania 기생충의 독성을 평가 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법

Summary

모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.

Abstract

Leishmania, leishmaniasis의 원인이 되는 에이전트의 수명 주기는 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트 간에 각각 대체 항목입니다. 모든 Leishmania 종의 척 추가 있는 단계 호스트 세포 안에 있는 leishmaniasis의 병원 성 증상이 널리, infective 수 종에 따라 매우 치명적인 내장 질병 형태에 양성 피부 병 변에서 다를 수 있습니다. 그들의 수명 주기입니다. Leishmania infectivity은 따라서 직접 관련이 침공, 생존과 parasitophorous 그들 (PVs) 대 식 세포 내에서 복제 하는 기능. 따라서, 독성을 결정 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 제공 침 복제 하는 기생충의 능력을 평가 합니다. Leishmaniasis 개발 동물 모델을 사용 하 여 공부 하는 것은, 지루한 자주 하기가 어렵고, 특히 pathogenically 중요 한 내장 형태 와입니다. 여기 골 수 유래 세포 (BMMs)에 세포내 Leishmania 개발을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 세포내 기생충 숫자 72 96 h 다음 감염에 대 한 24 시간 간격에 따라 결정 됩니다. 이 메서드는 Leishmania 독성에 다양 한 유전적 요인의 영향의 신뢰할 수 있는 결정에 대 한 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 어떻게 Leishmania 미토 콘 드리 아 철 운송업 자 유전자 (LMIT1)의 단일 대립 유전자 삭제 손상 수 Leishmania amazonensis 돌연변이 스트레인 LMIT1/ΔLmit1 의 BMMs, 내부 성장 보여 야생-타입에 비해 독성에서의 급격 한 감소를 반영 합니다. 이 분석 결과 또한 호스트 병원 체 상호 작용에 다양 한 요인 (영양소, 반응성 산소 종 등)의 영향을 분석을 개별적으로 조작할 수 있습니다 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 따라서, 적절 한 실행 및 BMM 감염 연구의 정량화 기존의 동물 모델 연구에 대 한 비-침략 적, 급속 한, 경제, 안전 하 고 안정적인 대안을 제공합니다.

Introduction

Leishmaniasis는 protozoan 기생충 종의 속 Leishmania로 인 한 인간의 질병의 광범위 한 스펙트럼을 말합니다. 약 12만 명이 현재 감염 된 Leishmania 전세계, 그리고 350만 이상의 위험이 있습니다. 질병 병리학 Leishmania 종에 고 호스트 요인에 따라 그리고 증상 무해 한 자기 치유 피부 병 변에서 치명적인 visceralizing 형태 다. 최악의 인간 질병으로 말라리아 후 순위 protozoan 기생충¹감염에의 한 치료, 내장 leishmaniasis 치명적인 경우. 질병 병 리와 증상에 광범위 한 차이도 불구 하 고 모든 Leishmania 종 digenic 수명-주기 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트를 각각 교대로 있다. 내부 척추 동물, Leishmania 침공에 대 한 호스트 세포를 대상 하 고 parasitophorous 그들 (PVs), 높은 악성의 amastigote 형태의 복제 속성 phagolysosomes의 산 성 구획의 형성을 유발. Amastigotes 만성 감염 시 호스트 조직에서 유지 하 고 전달 될 수 있는 감염 되지 않은 앞으로 sandflies, 전송 주기를 완료. 따라서, 인간의 질병 개발의 맥락에서 amastigotes는 가장 중요 한 Leishmania 생명주 기 양식². Amastigotes 대 식 세포 증후군 내부 복제 하는 방법을 조사 하는 것이 중요 이해 Leishmania 독성^3,,45,,67 와 새로운 효능 요법의 개발입니다.

여기 정기적으로 Leishmania 감염 및 시간이 지남에 세포내 Leishmania 수의 양적 평가 포함 하는 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 복제 연구를 우리의 실험실에 의해 사용 되는 방법을 설명 합니다. 과정 포함 Leishmania 그리고 부 량의 문화에서 대 식 세포, 생체 외에서 감염 감염 형태 (metacyclic promastigotes 또는 amastigotes)와 마우스 골 수에서 분화 monocytes의 수확은 세포내 기생충 감염 다음 72 96 h의 기간에 대 한 모든 24 시간 간격의 수입니다. 이 분석 결과 여러 환경 요인 및 기생충의 유전자, 노상 강도 의해 더 확인 되었다 L. amazonensis 독성을 홍보에 철의 중요 한 역할의 식별을 포함 하 여 영향을 확인 하기 위해 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. 마우스^{6,,89,10,11,12,13,14,15 병 변 개발 연구} . 때문에 모든 병원 성 Leishmania 종 설정할 호스트 세포 안에 그들의 일차 틈새,이 분석 결과 모든 Leishmania 종에서 독성 결정에 대 한 보편적으로 사용할 수 있습니다.

BMM 감염 수행 단일 세포 수준에서 호스트-기생충 상호 작용의 분석 및 따라서 Leishmania 기생충 그들의 기본 설정된 호스트 microenvironment, 대 식 세포의 PVs 상호 작용 하는 방법에 대 한 더 광범위 한 이해를 수 있습니다. 대 식 세포 감염 분석 실험 성공적으로 사용 되었습니다 여러 그룹^{16,17,18,19,20,,2122} 탐험 호스트 macrophage Leishmania 특정 유전자와 세포내 감염 특징 복잡 한 상호 작용에 있는 그들의 잠재적인 관련 기능. BMM 감염 microbicidal 산화 질소 생산, 반응성 산소 종의 생성 및 다른 조건 같은 세포내 생존에 영향을 주는 호스트 요인의 영향에의 한 읽기로 기생충 성장의 정량화를 허용 리소좀-같은 PVs²³내부 발생 했습니다. 대 식 세포 감염 분석 치료 개발^13,24에 대 한 잠재적인 안티 leishmanial 마약 단서를 식별 하도 이용 되어 있다.

BMM 감염의 생체 외에서 특성 Leishmania 독성을 평가 하기 위해 다른 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 그러나, 시간이 지남에 세포내 기생충 생존의 메커니즘을 검토 하는 여러 이전의 연구 속도^20,,2124로 감염을 계량 하지 않았다. 또한, 시간이 지남에 vivo에서 감염 다음에 초점을 맞춘 많은 연구 그렇게 피부 병 변의 크기와 직접 관련 없는 기생충 복제^25,26 다른 생리 적인 증상을 측정 하 여 ^{, 27}. vivo에서 감염 기생충 독성 평가에 대 한 엄격한 접근 이지만 혼자 붓기 노상 강도에 따라 병 변 크기 측정은 종종 적절 한, 그들은 감염 된 조직에서 염증 반응을 반영 하지는 기생충의 절대 수입니다. 따라서, 노상 강도 병 변 개발 분석 뒤에 감염 된 조직, 기생충 부하의 정량화 해야 긴 제한 희석을 요구 하는 절차는²⁸분석 실험. 또한, vivo에서 연구는 종종 포함 관심^6,,89,10, 의 조직 추출 하는 시간에 서로 다른 지점에서 여러 동물을 희생 ^{11 , 13}. 대조적으로, BMMs의 다 수는 단지 하나의 동물에서 얻어질 수 있다 고이 세포는 다양 한 지점에서 시간에 감염의 평가 허용 하는 조건에서 도금 될 수 있다. 또한, vivo에서 연구에 비해, 실험 조건 제어가 있습니다 BMM 감염 체 외에서 수행. 스스로 기생충 함께 감염 되는 세포를 측정 복합성 감염 (MOI)의 문화 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 이러한 요소를 세밀 하 게 제어 키 이산 세포질 통로의 특성을 식별 하 고 감염의 과정에 미치는 영향을 이해 하실 수 있습니다.

이러한 이점을 감안할 때, 그것은 다소 놀라운 Leishmania 독성을 공부 하는 아주 몇몇 그룹 세포에서 세포내 복제의 양적 평가의 활용을 찍은 지금까지 있다. 이 문서에서는, 우리는이 분석 결과의 더 광범위 한 이용을 저해 하 고 적절 한 구현을 촉진 하기 위하여 단계별 프로토콜을 제공 수 있습니다 일반적인 함정 토론. 정밀도 및 다양성을 고려 하면 우리가 여기 설명 BMM 감염 분석 결과 하지만 이용 될 수 있다 탐험 Leishmania 독성에 영향을 미치는 호스트 병원 체 상호 작용 뿐만 아니라 내부 복제 하는 다른 미생물을 공부 하 대 식 세포²⁹ 중요 한 것은,이 분석 결과 또한 안티-leishmanial 약물 개발에 대 한 신속 하 고 경제적인 전 임상 스크리닝 방법으로 개발할 수 있습니다.

Protocol

모든 실험 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 권장 사항에 따라 건강의 국가 학회에 의해 실시 했다 고 메릴랜드 대학 IACUC에 의해 승인 했다. 섹션 1-4에에서 설명 된 모든 단계 생물 층 류 캐비닛 안으로 밖으로 aseptically 실행 한다. 개인 보호를 사용 해야 합니다, 그리고 실험의 모든 단계에 걸쳐 라이브 Leishmania 기생충의 처리 하는 동안 주의 행사 한다. 1. ?…

Representative Results

Leishmania 는 두 감염 양식-문화, 고정 단계에서 procyclic promastigotes에서 차별화 하는 metacyclic promastigotes 및 amastigotes, 세포내 단계 (그림 1). L. amazonensis같은 일부 Leishmania 종, amastigotes 또한 분화 될 수 있다 axenic 문화에 낮은 pH (4.5)과 온도 (32 ° C) 조건 BMM PVs 안에서 발견 된 것과 유사한 promastigote 셀을 이동 하 여 8 …

Discussion

위에서 설명한 BMM 감염 분석 결과 의해 생성 하는 양적 데이터 수 감염 속도 상대적으로 짧은 기간 (최대 2 주, 2에 비해 독성 속성에서 변경의 신뢰할 수 있는 결정을 조사 개월 vivo에서 실험에 필요한). 이 방법은 DNA 특정 염료 DAPI는 특히 대 식 세포 및 기생충 핵, 얼룩 및 신속한 식별 및 감염 된 세포의 정량화를 허용에 의존 합니다. 비교, Giemsa 같은 다른 얼룩 시각적 분석^37</su…

Materials

6 well cell culture plate	Cellstar	657160
Adenine	Acros Organics	AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL)	Fisherbrand	02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL)	Fisherbrand	02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL)	Fisherbrand	02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10	Aspen Surgical	371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe	Becton Dickinson (BD)	309604
BD Precisionglide Needle, 25G	Becton Dickinson (BD)	305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm	Cellstar	627 160
Cell Culture Flask	Cellstar	660175
Cover Glasses: 12 mm circles	Fisherbrand	12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306
D-Biotin	J.T. Baker	C272-00
EDTA	Sigma Aldrich	EDS
Ethyl alcohol 200 proof	Pharmco-AAPER	111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish	Corning	351029
Fetal Bovine Serum	Seradigm	1500-500
Ficoll400	Sigma Aldrich	F8016
Fluorescence Microscope	Nikon	E200
Goat anti-mouse IgG Texas red	Invitrogen	T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488	Invitrogen	A-11034
Hemin	Tokyo Chemical Industry Co. LTD	H0008
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
Isoton II Diluent	Beckman Coulter	8546719
L-Glutamine	Gemini	400-106
Medium 199 (10X)	Gibco	11825-015
Na pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Paraformaldehyde	Alfa Aesar	43368
Penicillin/Streptomycin	Gemini	400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-)	ThermoFisher	14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL	Cellstar	188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL	Cellstar	227 261
ProLong Gold antifade reagent	ThermoFisher	P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4B
Recombinant Human M-CSF	PeproTech	300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093
Triton X-100 Surfactant	Millipore Sigma	TX1568-1
Trypan Blue	Sigma Aldrich	T8154
Delicate Scissors, 4 1/2"	VWR	82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
Microscope Slides	VWR	16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold	Beckman Coulter	6605699