Quantification de la croissance à l’intérieur de Macrophages intracellulaire est un rapide et une méthode fiable pour évaluer la Virulence de Leishmania
Summary
Toutes les espèces pathogènes de Leishmania résident et répliquent à l’intérieur de macrophages de leurs hôtes vertébrés. Nous présentons ici un protocole pour infecter les macrophages dérivés de la moelle osseuse souris dans la culture avec la Leishmania, suivie d’une quantification précise de la cinétique de croissance intracellulaire. Cette méthode est utile pour l’étude des facteurs individuels qui influencent l’interaction hôte-pathogène et la virulence de Leishmania .
Abstract
Le cycle de vie de Leishmania, l’agent causal de la leishmaniose, alterne entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et vertébrés hôtes, respectivement. Alors que les symptômes pathogènes de la leishmaniose peuvent varier considérablement, de lésions cutanées bénignes aux formes hautement mortelle maladie viscérale selon l’espèce infectieux, toutes les espèces de Leishmania résident à l’intérieur de macrophages de l’hôte pendant l’étape de vertébrés du leur cycle de vie. Leishmania infectiosité est donc directement liée à sa capacité à envahir, de survivre et de répliquer dans les vacuoles parasitophore (PVs) à l’intérieur des macrophages. Ainsi, évaluer la capacité du parasite à répliquer intracellulairement sert une méthode fiable pour déterminer la virulence. Étudier le développement de la leishmaniose à l’aide de modèles animaux est long, fastidieux et souvent difficile, en particulier avec les formes viscérales rôle importants. Nous décrivons ici une méthodologie pour suivre le développement intracellulaire de Leishmania dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs). Nombre de parasites intracellulaires est déterminés à intervalles de 24 h pour 72-96 h après l’infection. Cette méthode permet une détermination fiable des effets de divers facteurs génétiques sur la virulence de Leishmania . À titre d’exemple, nous montrons comment une délétion seul allèle du gène Mitochondrial transporteur de fer Leishmania (LMIT1) porte atteinte à la capacité de la souche mutante de Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 à pousser à l’intérieur de BMMs, soit une réduction drastique dans la virulence par rapport au type sauvage. Ce dosage permet également un contrôle précis des conditions expérimentales, qui peuvent être manipulés individuellement pour analyser l’influence de divers facteurs (nutriments, espèces réactives de l’oxygène, etc.) sur l’interaction hôte-pathogène. Par conséquent, l’exécution appropriée et la quantification des études d’infection BMM fournissent une alternative non invasive, rapide, économique, sécuritaire et fiable pour les études sur des modèles animaux conventionnels.
Introduction
La leishmaniose se réfère à un large éventail de maladies humaines causées par les espèces de protozoaire parasite du genre Leishmania. Environ 12 millions de personnes sont actuellement infectées par Leishmania dans le monde entier, et plus de 350 millions sont menacés. La pathologie de la maladie dépend de l’espèce de Leishmania et facteurs de l’hôte, et symptômes varient d’innofensif auto guérison des lésions cutanées aux formes visceralizing mortelles. Si non traitée, viscérale de la leishmaniose est fatale, rang seulement après le paludisme comme la plus meurtrière maladie humaine causée par une infection par un protozoaire parasite1. En dépit des différences de grande envergure dans la pathologie de la maladie et les symptômes, toutes les espèces de Leishmania ont un cycle de digéniques alternant entre promastigote et amastigote stades à l’intérieur de l’insecte et les hôtes vertébrés, respectivement. Intérieur vertébrés, Leishmania ciblent les macrophages hôtes pour invasion et induisent la formation de vacuoles parasitophore (PVs), compartiments acides avec les propriétés des phagolysosomes où les formes hautement virulente amastigote répliquent. Amastigotes persistent dans les tissus de l’hôte lors d’infections chroniques et peuvent être passés vers des phlébotomes, complétant le cycle de transmission. Par conséquent, dans le contexte du développement de la maladie humaine, amastigotes sont le plus important Leishmania lifecycle formulaire2. Étudier comment les amastigotes se reproduire à l’intérieur de macrophages PVs est essentiel pour comprendre Leishmania virulence3,4,5,6,7 et la développement de nouveaux traitements efficaces.
Nous décrivons ici une méthode régulièrement utilisée par notre laboratoire pour étudier les maladies infectieuses Leishmania et réplication dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs), qui prévoit une évaluation quantitative du nombre d’intracellulaire Leishmania au fil du temps. Le processus implique la récolte des monocytes de moelle osseuse de souris et de la différenciation à macrophages en culture, in vitro l’infection avec des formes infectantes (promastigotes métacycliques ou amastigotes) de Leishmania et quantification de la nombre de parasites intracellulaires à chaque intervalle de 24h pour une période de 72-96 h après l’infection. Ce test a été utilisé dans notre laboratoire pour déterminer l’effet de plusieurs facteurs environnementaux et les gènes parasites, y compris l’identification du rôle crucial de fer dans la promotion de L. amazonensis virulence qui a été également validé par coussinet plantaire études de développement de lésions en souris6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Étant donné que toutes les espèces de Leishmania pathogènes établissent leur niche réplicative à l’intérieur de macrophages de l’hôte, ce test peut être utilisé universellement pour les déterminations de la virulence chez toutes les espèces de Leishmania .
Effectuant des infections BMM permet l’analyse des interactions hôte-parasite au niveau de la cellule unique et donc une plus vaste compréhension de comment les parasites Leishmania interagissent avec leur microenvironnement hôte préféré, le PVs des macrophages. Macrophage infection dosages ont été utilisées avec succès par plusieurs groupes16,17,18,19,20,21,22 à explorer fonctions de macrophage hôte et Leishmania de gènes spécifiques et leur implication potentielle dans les interactions complexes qui caractérise l’infection intracellulaire. Les infections BMM permettent la quantification de la croissance du parasite comme une lecture de l’impact des facteurs de l’hôte qui influencent la survie intracellulaire, tels que la production d’oxyde nitrique microbicide, génération d’espèces réactives de l’oxygène et autres conditions défavorables rencontrés dans le lysosome type PVs23. Macrophage infection essais ont également été utilisés pour identifier prospects de drogue anti-leishmanies potentiels pour le développement de thérapeutiques13,24.
Le caractère in vitro des infections BMM offre plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes pour évaluer la virulence de Leishmania . Cependant, plusieurs études antérieures, examen des mécanismes de survie du parasite intracellulaire au fil du temps n’ont pas quantifié l’infection comme un taux de21,20,24. En outre, beaucoup d’études axé sur le suivi des infections in vivo au fil du temps l’a fait en mesurant la taille des lésions cutanées et autres symptômes physiologiques qui ne sont qu’indirectement liées au parasite réplication25,26 , 27. in vivo de l’infection est une approche rigoureuse pour évaluer la virulence du parasite, mais les mesures de taille de lésion basées sur coussinet plantaire gonflement seul sont souvent insuffisantes, car elles reflètent la réponse inflammatoire dans les tissus infectés et pas la nombre absolu de parasites. Pour cette raison, le développement des lésions coussinet plantaire dosages doivent être suivies par la quantification de la charge parasitaire dans les tissus infectés, une procédure qui exige la dilution limite longue tests28. En outre, des études in vivo impliquent souvent sacrifier plusieurs animaux à différents points dans le temps pour en extraire des tissus d’intérêt6,8,9,10, 11 , 13. en revanche, un grand nombre de BMMs peut être obtenu d’un seul animal, et que ces cellules peuvent être plaqués dans des conditions qui permettent l’évaluation d’infection à divers points dans le temps. En outre, par rapport aux études in vivo , effectuant des infections in vitro BMM permet une plus grande maîtrise des conditions expérimentales. Quantifier les macrophages infectés ainsi que les parasites permet un contrôle précis de la multiplicité d’infection (MOI) et des conditions de culture. Contrôle précis sur ces facteurs peut être la clé dans l’identification des caractéristiques des voies cellulaires discrets et dans la compréhension de leur impact sur l’évolution de l’infection.
Compte tenu de ces avantages, il est quelque peu surprenant que très peu étudient des Leishmania virulence ont jusqu’à présent pleinement tiré profit de l’évaluation quantitative de réplication intracellulaire dans les macrophages. Dans cet article, nous discutons des pièges communs qui peuvent être gênant l’utilisation plus étendue de ce test et fournir un protocole étape par étape pour faciliter son application correcte. Compte tenu de sa précision et la polyvalence, le dosage d’infection BMM que nous décrivons ici peut non seulement servir d’explorer les interactions hôte-pathogène qui influent sur la virulence de la leishmaniose , mais aussi d’étudier d’autres microorganismes qui reproduisent à l’intérieur macrophages29. Ce qui est important, ce dosage peut également être développé comme une méthode de dépistage pré-clinique rapide et économique pour le développement de médicaments anti-leishmanies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les données quantitatives produites par l’essai d’infection BMM décrit ci-dessus, permet aux enquêteurs d’obtenir des taux d’infection et une détermination fiable des changements dans les propriétés de virulence dans un laps de temps relativement court (maximum 2 semaines, par rapport à la 2 mois nécessaires pour des expériences in vivo ). Cette méthode s’appuie sur le colorant spécifique de l’ADN DAPI, qui précisément les taches noyaux macrophage et parasite et permet une identification…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de la subvention RO1 AI067979 de la santé à RNF.
YK est récipiendaire de la bourse de premier cycle de l’Howard Hughes Medical Institute de l’Université du Maryland à College Park.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host’s autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
