Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania
Summary
Alle Pathogene Leishmania -Arten befinden sich und innen Makrophagen ihrer Wirbeltier Wirte zu replizieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur murine Knochenmark stammenden Makrophagen in der Kultur mit Leishmanien, gefolgt von präzise Quantifizierung der intrazellulären Wachstum Kinetik zu infizieren. Diese Methode eignet sich für das Studium der einzelnen Faktoren, die die Wirt-Pathogen Interaktionen und Leishmaniose Virulenz.
Abstract
Der Lebenszyklus der Leishmaniose, die Erreger der Leishmaniose, wechselt zwischen Promastigote und Amastigote Phasen innerhalb der Insekten und Wirbeltiere Gastgeber, beziehungsweise. Während Pathogene Symptome der Leishmaniose stark und von gutartigen Hautveränderungen sehr tödliche Krankheit viszeralen Formen abhängig von der infektiösen Sorte variieren können befinden sich alle Leishmania -Arten im Host Makrophagen in der vertebrate Phase des Ihren gesamten Lebenszyklus hinweg. Leishmaniose Infektiosität bezieht sich daher direkt auf seine Fähigkeit, einzudringen, überleben und replizieren innerhalb Parasitophorous Vakuolen (PVs) in Makrophagen. Beurteilung der Parasit Fähigkeit, intrazellulär zu replizieren dient als zuverlässige Methode zur Bestimmung der Virulenz. Leishmaniose-Entwicklung mit Tiermodellen zu studieren ist zeitraubend, mühsam und oft schwierig, vor allem mit den pathogenetisch wichtigen viszeralen Formen. Wir beschreiben hier eine Methode um die intrazelluläre Entwicklung der Leishmaniose im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) folgen. Intrazellulären Parasiten Zahlen werden in 24 h-Intervallen für 72-96 h nach Infektion bestimmt. Diese Methode ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung der Auswirkungen von verschiedenen genetischen Faktoren auf Leishmaniose Virulenz. Als Beispiel zeigen wir, wie eine einzelne Allel Löschung des Leishmaniose mitochondriale Eisen-Transporter-Gens (LMIT1) beeinträchtigt die Fähigkeit der Leishmaniose Amazonensis Mutante LMIT1/ΔLmit1 , innen BMMs wachsen, eine drastische Reduzierung der widerspiegelt Virulenz im Vergleich zu Wildtyp. Dieser Test ermöglicht auch präzise Kontrolle der experimentellen Bedingungen, die einzeln bearbeitet werden können, um den Einfluss verschiedener Faktoren (Nährstoffe, reaktive Sauerstoffspezies, etc.) auf die Wirt-Pathogen Interaktionen zu analysieren. Daher bieten die geeignete Ausführung und Quantifizierung der BMM Infektion Studien eine nicht-invasive, schnelle, wirtschaftliche, sichere und zuverlässige Alternative zu herkömmlichen Tiermodell Studien.
Introduction
Leishmaniose bezieht sich auf ein breites Spektrum von menschlichen Krankheiten, die durch einzelliger Parasit Arten der Gattung Leishmaniaverursacht. Etwa 12 Millionen Menschen sind derzeit mit Leishmanien weltweit infiziert, und mehr als 350 Millionen sind gefährdet. Die Pathologie der Krankheit hängt von Leishmania -Arten und Host Faktoren und Symptome variieren von harmlosen selbstheilende Hautläsionen zu tödlichen visceralizing Formen. Wenn unbehandelt, viszerale Leishmaniose tödlich ist, Ranking erst nach Malaria als die tödlichsten Krankheiten verursacht durch eine Infektion mit ein einzelliger Parasit-1. Trotz der vielfältigen Unterschiede in Krankheit Pathologie und Symptome haben alle Leishmania -Arten einen Digene Lebenszyklus Promastigote und Amastigote Phasen innen Insekten und Wirbeltiere Gastgeber jeweils abwechselnd. Innen Wirbeltiere, Leishmaniose Ziel Host Makrophagen für Invasion und induzieren die Bildung von Parasitophorous Vakuolen (PVs), saure Kompartimente mit Eigenschaften von Phagolysosomes wo die hoch virulenten Amastigote Formen replizieren. Amastigoten bestehen in Host Gewebe bei chronischen Infektionen und können weitergegeben werden vorwärts, nicht infizierten Sandmücken, Abschluss des Getriebe-Zyklus. Daher sind im Kontext der Entwicklung der menschlichen Krankheit, Amastigoten die wichtigsten Leishmaniose Lifecycle Form2. Untersuchen, wie die Amastigoten innen Makrophagen PVs repliziert ist von entscheidender Bedeutung für Verständnis Leishmaniose Virulenz3,4,5,6,7 und die Entwicklung neuartiger wirksame Therapien.
Wir beschreiben hier eine Methode, die regelmäßig von unserem Labor verwendet, um studieren Leishmaniose Infektion und Replikation im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs), die quantitative Bewertung der Anzahl der intrazellulären Leishmaniose im Laufe der Zeit beinhaltet. Der Prozess umfasst das Ernten von Monozyten aus Maus Knochenmark und Differenzierung zu Makrophagen in der Kultur, in-vitro- Infektion mit infektiösen Formen (metacyclic Promastigotes oder Amastigoten) von Leishmaniose und Quantifizierung der Anzahl der intrazellulären Parasiten an alle 24 h-Intervall für einen Zeitraum von 72-96 h nach Infektion. Dieser Test wurde in unserem Labor verwendet, um ermitteln die Auswirkungen von mehreren Umweltfaktoren und Parasiten Gene, einschließlich Ermittlung der kritischen Rolle des Eisens bei der Förderung von L. Amazonensis Virulenz, die weiter von Straßenräuber validiert wurde Läsion Entwicklungsstudien in Mäusen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Da alle Pathogene Leishmania -Arten ihre replikativen Nische innen Makrophagen Host herstellen, kann dieser Assay universell für Virulenz Bestimmungen in allen Leishmania -Arten verwendet werden.
Durchführung von BMM Infektionen ermöglicht Analyse der Wirt-Parasit-Interaktionen auf der Ebene der einzelnen Zelle und damit eine umfassendere Verständnis der Interaktion von Leishmania -Parasiten und ihre bevorzugten Host Mikroumgebung, PVs von Makrophagen. Makrophagen-Infektion-Assays sind durch mehrere Gruppen16,17,18,19,20,21,22 erfolgreich benutzt worden, um zu erkunden Funktionen der Host Makrophagen und Leishmaniose spezifischer Gene, und ihre mögliche Einbindung in das komplexe Zusammenspiel, das intrazelluläre Infektion charakterisiert. BMM Infektionen erlauben Quantifizierung der Parasit Wachstum als eine Auslesung der Auswirkungen der Host Faktoren, die intrazelluläre überleben, wie mikrobizider Stickoxid-Produktion, Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies und andere nachteiligen Bedingungen beeinflussen im Inneren der Lysosomen-wie PVs23begegnet. Makrophagen Infektion Assays wurden auch genutzt, um Anti-Leishmanial Droge Interessenten für therapeutische Entwicklung13,24zu identifizieren.
Die in-vitro- Natur BMM Infektionen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden Leishmaniose Virulenz zu beurteilen. Jedoch mehrere frühere Studien, die Mechanismen der intrazellulären Parasiten überleben im Laufe der Zeit nicht quantifizieren Infektion als ein Satz20,21,24. Darüber hinaus Tat viele Studien konzentriert sich auf folgende in-Vivo -Infektionen im Laufe der Zeit dies durch die Messung der Größe der kutanen Läsion und andere physiologische Symptome, die nur indirekt auf Parasiten Replikation25,26 , 27. in-Vivo -Infektion ist einen stringenten Ansatz Parasit Virulenz zu beurteilen, aber Läsion Größenmessungen Straßenräuber Schwellung allein anhand sind oft unzureichend, da sie die Entzündungsreaktion im infizierten Gewebe widerspiegeln und nicht die absolute Anzahl der Parasiten. Aus diesem Grund Straßenräuber Läsion Entwicklung haben Assays mit anschließendem Quantifizierung der Parasit Last im infizierten Gewebe Proben eine Prozedur, die langwierige begrenzende Verdünnung erfordert28. Darüber hinaus werden in Vivo Studien häufig mehrere Tiere an verschiedenen Punkten in der Zeit von Interesse6,8,9,10, Gewebe zu extrahieren zu Opfern 11 , 13. dagegen zahlreicher BMMs kann nur ein Tier entnommen werden, und diese Zellen können unter Bedingungen, die an verschiedenen Punkten in der Zeit der Infektion bewerten überzogen werden. Darüber hinaus erlaubt im Vergleich zu in-Vivo -Studien, in-vitro- BMM Infektionen mehr Kontrolle über die experimentellen Bedingungen. Quantifizierung der Makrophagen, zusammen mit dem Parasiten selbst angesteckt zu werden, ermöglicht präzise Kontrolle über die Multiplizität der Infektion (MOI) und der Kulturbedingungen. Genaue Kontrolle über diese Faktoren kann Schlüssel Merkmale der diskreten zelluläre Signalwege zu identifizieren und ihre Auswirkungen auf den Verlauf der Infektion zu verstehen sein.
Angesichts dieser Vorteile, ist es wenig verwunderlich, dass sehr wenige Gruppen studieren Leishmaniose Virulenz bisher voll quantitative Bewertung der intrazelluläre Replikation in Makrophagen ausgenutzt haben. In diesem Artikel besprechen wir häufige Probleme, die möglicherweise behindern die weitergehende Nutzung des Assays, und bieten eine schrittweise Protokoll um seine korrekte Umsetzung zu erleichtern. In Anbetracht seiner Präzision und Vielseitigkeit kann der BMM-Infektion-Assay, die, den wir hier beschreiben, nicht nur genutzt werden, Wirt-Pathogen Interaktionen beeinflussen Leishmaniose Virulenz zu erkunden, sondern auch andere Mikroorganismen zu studieren, die im Inneren zu replizieren Makrophagen29. Wichtig ist, kann dieser Test auch als eine schnelle und kostengünstige prä-klinischen Screening-Methode für die Medikamentenentwicklung Anti-Leishmanial entwickelt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die quantitative Daten von der BMM Infektion Test oben beschrieben, ermöglicht Ermittler Infektionsraten und eine zuverlässige Bestimmung der Veränderungen der Virulenzeigenschaften in einem relativ kürzeren Zeitraum (maximal 2 Wochen, im Vergleich zu den 2 zu erhalten Monate für in Vivo Experimente erforderlich). Diese Methode beruht auf der DNA-spezifischen Farbstoff DAPI, speziell Flecken Makrophagen und Parasiten Kernen und ermöglicht schnelle Identifizierung und Quantifizierung der infizierten Zellen….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grant RO1 AI067979 NWA unterstützt.
YK ist Bachelor Fellow der Howard Hughes Medical Institute/University of Maryland, College Park.
Materials
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
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