שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות
Summary
כאן אנו מציגים, ניגודיות שני פרוטוקולים נהגה decellularize רקמות הצמח: גישה מבוססת דטרגנט וגישה ללא חומרי ניקוי. שתי השיטות להשאיר מאחור את מטריצה חוץ-תאית של רקמות הצמח בשימוש, אשר אז יכול להיות מנוצל כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.
Abstract
השתלים עצמיים סינתטי, מהחי המשמשים כעת בתור פיגומים להחלפת רקמות יש מגבלות בשל זמינות נמוכה, הביו המסכן ועלות. רקמות הצמח יש מאפיינים חיוביים שהופכים אותם באופן ייחודי מתאים להשתמש פיגומים, כגון שטח גבוהה, תחבורת מים מעולה ושמירה, נקבוביות מחוברים, המקובץ רשתות כלי דם, ומגוון רחב של מכונות מאפיינים. שתי שיטות מוצלחת של צמח decellularization עבור יישומים הנדסת רקמות מתוארים כאן. השיטה הראשונה מבוססת על אמבטיות דטרגנט להסיר חומר הסלולר, הדומה שנוצרו קודם לכן שיטות השתמשו כדי לנקות רקמות יונקים. השניה היא שיטה ללא דטרגנט הותאם מפרוטוקול מבודד להערכת עלה, כרוכה בשימוש אקונומיקה מחוממת וחדר אמבט מלח כדי לנקות את העלים והגבעולים. שתי השיטות תשואות פיגומים עם תכונות מכניות דומות, השפעה מטבולית סלולרית נמוכה, ובכך מאפשר למשתמש לבחור פרוטוקול אשר מתאים יותר יישום המיועד שלהם.
Introduction
הנדסת רקמות הופיע בשנות השמונים כדי ליצור רקמה חיה תחליפים, ואפשרות כתובת משמעותית האיברים והרקמות מחסורים1. אסטרטגיה אחת השתמשה פיגומים כדי לעורר את הגוף להתחדש חסרים לרקמות או לאיברים מדריך. למרות מתקדם ייצור גישות כגון הדפסה תלת-ממדית יצרו פיגומים עם מאפיינים הפיזיים ייחודיים, היכולת לייצר פיגומים עם מגוון רחב של מאפיינים פיזיים וביולוגיים השגה נשאר אתגר2 , 3. יתר על כן, עקב מחסור של רשת כלי הדם פונקציונלי, טכניקות אלו היה מוגבל בהתחדשות רקמות תלת-ממדי. השימוש decellularized ברקמות בעלי חיים ואנושית כמו פיגומים עזר תוך עקיפת זו בעיה4,5,6,7. עם זאת, עלות גבוהה, השתנות אצווה-כדי-אצווה וזמינות מוגבלים עלולה להגביל השימוש הנרחב של פיגומים חיה decellularized8. ישנם חששות לגבי העברת מחלות פוטנציאליות לחולים ותגובה אוטואימונית כמה רקמות בתרבית של decellularized9.
תאית, נגזר צמח ו מקורות חיידקי, נעשה שימוש נרחב לייצר biomaterials למגוון רחב של יישומים רפואה רגנרטיבית. להלן מספר דוגמאות: עצם10,11, סחוס12,13,14 ו-15ריפוי הפצע. פיגומים זה מורכבות תאית יש יתרון נוסף בכך הם הם עמידים עמידים להיות שבור על-ידי תאי יונקים. זה בשל העובדה כי בתרבית של תאים אינם מייצרים אנזימים הדרושים לשבור מולקולות תאית. לשם השוואה, פיגומים המיוצר באמצעות מקרומולקולות של מטריצה חוץ-תאית, כמו קולגן, מפורקים ברצון16 , לא יכול להיות גם מתאים ליישומי לטווח ארוך. קולגמן יכול מיוצב על ידי cross-linking כימי. עם זאת, יש פשרה עקב רעילות הטבועה של cross-linkers להשפיע על התאימות של ה-פיגומים17. לעומת זאת, תאית יש פוטנציאל להיות נוכח באתר של ההשתלה לתקופות ממושכות של זמן כי הוא חסין מפני השפלה אנזימטי תאים בתרבית של18,19,20. זה יכול להשתנות על-ידי כיוונון הקצב של השפלה באמצעות הידרוליזה רעלני ואספקה שיתוף של פיגומים עם cellulases21. התאימות של תאית decellularized הצמחי פיגומים ויוו הוכח גם במסגרת מחקר על עכברים22.
דרך מאות מיליוני שנים של אבולוציה, צמחים יש מעודן שלהם מבנה והרכב כדי להגביר את היעילות של תחבורה נוזלים ושמירה. כלי הדם צמח למזער הידראולי ההתנגדות על ידי הסתעפות לתוך כלי קטן יותר, בדומה להערכת יונקים על פי החוק של מורי23. לאחר decellularization, רשת מורכבת של הצמח של כלים נקבוביות מחוברים נשמר. בהתחשב המספר העצום של מיני צמחים שונים זמינים, פיגומים הצמחי יש את היכולת להתגבר על מגבלות עיצוב משפיע כעת פיגומים הנדסת רקמות24,25. למשל, Modulevsky. et al. הוכיח כי ההעברה אנגיוגנזה ותא התרחשה כאשר אפל decellularized רקמות הושתל subcutaneously על גב עכבר22. באופן דומה, Gershlak. et al. הראה כי תאי אנדותל יכול להיות מבוגר בתוך להערכת העלים decellularized24. בניסוי נפרדים, Gershlak. et al. היו גם מסוגל להראות כי cardiomyocytes יכול להיות גדל על פני השטח של עלים, הצליחו חוזה24.
צמחים כוללים גם ארגון מורכב מן הטלפון הסלולרי הסולם מאקרוסקופית, שקשה להשיג אפילו עם טכניקות הייצור המתקדמים ביותר שפותחה עד היום. העיצוב הירארכי מורכבים של רקמות הצמח מחזק מסכום המרכיבים שלהם26אותם. צמחים בעלי שפע של תכונות מכאניות שונות החל נוקשה וקשוח רכיבים כגון הגבעולים, אלה הרבה יותר גמיש, גמיש כמו עלים27. העלים משתנים בהתאם המינים מבחינת גודל, צורה, לשבור את כוח, מידת vascularization, והוא מסוגל לשאת דרגות שונות של hydrophilicity. בסך הכל, מאפיינים אלה צמח מראים כי צמחים decellularized יכול לשמש פונקציונליים מאוד וייחודי ומכשור רפואי, כולל רקמות הנדסה פיגומים.
פרוטוקול זה מתמקד בשתי שיטות כדי decellularize רקמות הצמח, כגון עלים, גבעולים, לשימוש פיגומים בהנדסת רקמות. השיטה הראשונה היא טכניקה המבוססת על חומרי ניקוי המשתמשת סדרה של אמבטיות להסיר את ה-DNA והחומר הסלולר, אשר הותאם של טכניקה בשימוש נרחב decellularize יונקים ולשתול רקמות6,22,25 ,28,29,30. השיטה השנייה היא ללא דטרגנט והוא ממאמרו של פרוטוקול “skeletonization” משמש בדרך כלל כדי להסיר רקמות רכות של עלים31. בעבר הראו כי רותח עלים בפתרון אקונומיקה, סודיום ביקרבונט הקל פרידתה של להערכת הרקמות שמסביב31. טכניקה זו אפשר להביא חזרה על ניסויים שבוצעו ב 17 אתth ו המאותה 18, כגון העבודה של אלברטוס סבע32 ו אדוארד פאריש33. ניסויים אלה כיעד עוזב משנה הצמח, כגון עלים ופירות, שקוע במים לתקופות ממושכות של זמן (שבועות עד חודשים) ומאפשר הרקמות רך יותר לריקבון משם באופן טבעי. כאן הגישה “skeletonization” מותאמת לשימוש תנאים מתון יותר, כגון פעמים יותר זמן דגירה בטמפרטורות נמוכות, כדי להסיר את שאריות תאי וכדי למנוע באופן משמעותי לשבש את מבנה רקמות רכות. על הניסויים מפורט במסמך זה, שימשו שלושה סוגי צמחים: פיקוס hispida, Pachira aquatica , זן של Garcinia. התוצאות של ה-DNA כימות בדיקות מכניות, השפעה על פעילות חילוף החומרים הסלולר של שתי השיטות שתוארו.
Protocol
Representative Results
Discussion
במסמך זה, מתוארות שתי שיטות decellularize רקמות הצמח. התוצאות שהוצגו כאן, יחד עם התוצאות של מחקרים קודמים25, מציע כי הפרוטוקולים הושיט צפויים החלים מגוון רחב של זנים של צמחים, יכול להתבצע על גבעולים ועלים. הליכים אלה הם פשוטים, אינם דורשים ציוד מיוחד, כך הצמח decellularization יכול להתבצע במעב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ג’ון וירט של הגנים אולבריך לאספקת באדיבות דגימות שימוש בפרוייקט זה. עבודה זו נתמכת באופן חלקי על ידי הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (R01HL115282 אל-G.R.G.) הקרן הלאומית למדע (DGE1144804 J.R.G, G.R.G.), המחלקה לכירורגיה באוניברסיטת ויסקונסין ואת קרן הבוגרים (H.D.L.). עבודה זו גם נתמך בחלקה על ידי הסוכנות להגנת הסביבה (כוכב גרנט 83573701 מס), מכוני הבריאות הלאומיים (R01HL093282-01A1 ו- UH3TR000506), הקרן הלאומית למדע (IGERT DGE1144804).
Materials
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
| Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
| 8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
| Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
| Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
| Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| DMEM | Corning | MT50003PC | |
| Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |
References
- Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
- Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
- Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
- Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
- Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
- Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
- Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
- Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
- Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
- Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
- Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
- Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
- Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
- Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
- Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
- Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
- Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
- Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
- Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
- Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894 (2016).
- McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray’s law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
- Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
- Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
- Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
- Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
- Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835 (2014).
- Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
- Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
- Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
- Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246 (2007).
- Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
- Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
- Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
- Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923 (2003).
- Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. . Biology of Plants. , (2005).
- Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).
