Dos métodos de descelularización de tejidos vegetales para aplicaciones de ingeniería de tejidos
Summary
Aquí presentamos, y protocolos de contraste dos utilizan para decellularize los tejidos de la planta: un enfoque de base de detergente y un libre de detergente. Ambos métodos dejan la matriz extracelular de los tejidos de la planta utilizada, que luego puede ser utilizada como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.
Abstract
Los injertos autólogos, sintéticos y derivados de animales, actualmente utilizados como andamios para reemplazo de tejidos tienen limitaciones debido a la baja disponibilidad, pobre biocompatibilidad y costo. Los tejidos de la planta tienen características favorables que las hacen especialmente adecuado para utilizar como andamios, tales como superficie, excelente transporte y retención, porosidad interconectada, preexistente de redes vasculares y una amplia gama de mecánicas propiedades. Aquí se describen dos métodos exitosos de descelularización de planta para aplicaciones de ingeniería de tejidos. El primer método se basa en baños detergentes para quitar la materia celular, que es similar al previamente establecidos métodos utilizados para eliminar los tejidos mamíferos. El segundo es un método libre de detergente adaptado de un protocolo que aísla la vasculatura de la hoja y consiste en el uso de una lejía caliente y el baño de sal para limpiar las hojas y tallos. Ambos métodos producen andamios con propiedades mecánicas comparables y bajo impacto metabólico celular, lo que permite al usuario seleccionar el protocolo que mejor se adapte a su uso.
Introduction
Ingeniería de tejidos surgió en la década de 1980 para crear tejidos vivos sustitutos y potencialmente dirección importantes órganos y tejidos escasez1. Una de las estrategias ha utilizar andamios para estimular y guiar el cuerpo para regenerar los tejidos o los órganos. Aunque avanzados métodos de fabricación tales como impresión en 3-d han producido andamios con características físicas únicas, la capacidad para la fabricación de andamios con una amplia gama de propiedades físicas y biológicas viables sigue siendo un reto2 , 3. por otra parte, debido a la falta de una red vascular funcional, estas técnicas han sido limitadas en regeneración de tejido de 3 dimensiones. El uso de tejidos animales y humanos decellularized como andamios ha ayudado a eludir este problema4,5,6,7. Sin embargo, el alto costo, la variabilidad lote a lote y la disponibilidad limitada pueden limitar uso generalizado de animal decellularized andamios8. También hay preocupaciones sobre la potencial transmisión de enfermedades a los pacientes y reacción inmunológica a algunos tejidos mamíferos decellularized9.
Celulosa, derivada de plantas y fuentes bacterianas, se ha utilizado ampliamente para generar Biomateriales para una amplia gama de aplicaciones en medicina regenerativa. Algunos ejemplos incluyen:10,11, cartílago12,13,14 y15de cicatrización ósea. Los andamios que se componen de celulosa tienen un beneficio adicional que son durables y resistentes a ser desglosadas por células de mamífero. Esto es debido a que las células de mamífero no producen las enzimas necesarias para descomponer las moléculas de celulosa. En comparación, andamios producción con macromoléculas de la matriz extracelular, como colágeno, se descomponen fácilmente con16 y no sea idóneos para aplicaciones a largo plazo. Andamios de colágeno pueden ser estabilizados por reticulación química. Sin embargo, existe una relación inversa debido a la toxicidad inherente de los cross-linkers que afectan la biocompatibilidad de los andamios17. Por el contrario, la celulosa tiene el potencial de permanecer presentes en el lugar de implantación durante períodos prolongados de tiempo porque son impermeable a la degradación enzimática de las células mamíferas18,19,20. Esto puede modificarse mediante la regulación de la tasa de degradación a través de pretratamiento de hidrólisis y la entrega de los andamios con celulasas21. La biocompatibilidad de celulosa de origen vegetal decellularized andamios en vivo también se ha demostrado en un estudio realizado en ratones22.
A través de cientos de millones de años de evolución, las plantas han refinado su estructura y composición para aumentar la eficiencia de transporte de fluidos y la retención. Planta vasculares vasos minimizan resistencia hidráulica por ramifican en vasos más pequeños, similares a la vasculatura mamífera según23de la ley de Murray. Después de descelularización, se mantiene la red compleja de la planta de los vasos y poros interconectados. Teniendo en cuenta la gran cantidad de especies de plantas distintas disponibles, andamios de origen vegetal tienen el potencial para superar limitaciones de diseño que afecta actualmente a andamios en tejido ingeniería24,25. Por ejemplo, Modulevsky et al demostraron que la angiogénesis y migración celular ocurrió cuando apple decellularized tejido fue implantado por vía subcutánea en la parte posterior de un ratón22. Semejantemente, Gershlak et al. , demostró que las células endoteliales podrían ser crecidas dentro de la vasculatura de hojas decellularized24. En un experimento separado, Gershlak et al. también fueron capaces de demostrar que cardiomiocitos podrían cultivarse en la superficie de las hojas y pudieron contratar24.
Las plantas también incluyen organización compleja desde el celular a la escala macroscópica, que es difícil de conseguir incluso con las más avanzadas técnicas de fabricación desarrolladas hasta la fecha. El diseño jerárquico complejo de tejidos de la planta hace más fuerte que la suma de sus componentes26. Las plantas poseen una gran cantidad de propiedades mecánicas diferentes que van desde componentes rígidos y resistentes como los tallos, a unos mucho más flexibles y maleables como hojas27. Hojas varían dependiendo de la especie en términos de tamaño, forma, rompen la resistencia, el grado de vascularización y pueden llevar a diferentes grados de hidrofilicidad. En general, estas propiedades de la planta sugieren que decellularized las plantas pueden servir como dispositivos médicos únicos y altamente funcionales, como los andamios de la ingeniería del tejido.
Este protocolo se centra en dos métodos para decellularize los tejidos vegetales, como hojas y tallos, para el uso como andamios en ingeniería tisular. El primer método es una técnica basada en el detergente que utiliza una serie de baños para extraer ADN y materia celular, que ha sido adaptada de una técnica ampliamente utilizada decellularize mamíferos y vegetales tejidos6,22,25 ,28,29,30. El segundo método está libre de detergente y es una adaptación de un protocolo de “skeletonization” generalmente se utiliza para eliminar los tejidos blandos de hojas31. Trabajos previos demostraron que hirviendo las hojas en una solución de lejía y bicarbonato de sodio facilita la separación de la vasculatura de los tejidos blandos circundantes31. Esta técnica se puede citar a experimentos realizados en elth de 17 y18 siglos, tales como el trabajo de Albertus Seba32 y33de Edward Parrish . Estos experimentos de centrar dejando materia vegetal, como hojas y frutos, sumergieron en agua durante largos períodos de tiempo (semanas a meses) y permitir que los tejidos más suaves al decaimiento, naturalmente. Aquí el enfoque “skeletonization” está adaptado para utilizar condiciones más suaves, tales como tiempos de incubación más largos a temperaturas más bajas, para eliminar los residuos celulares y para evitar distorsionar significativamente la estructura de tejidos blandos. Para los experimentos detallados en este documento, se utilizaron tres tipos de plantas: Ficus hispida, Pachira aquatica y una especies de Garcinia. Resultados de la cuantificación de ADN, pruebas mecánicas e impacto en la actividad metabólica celular de ambos métodos se describen.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este documento, se describen dos métodos para decellularize los tejidos vegetales. Los resultados presentados aquí, junto con los resultados de25estudios anteriores sugieren que los protocolos planteados son probablemente aplicable a un amplio espectro de especies de plantas y se pueden realizar en tallos y hojas. Estos procedimientos son simples y no requieren de equipo especializado, para que planta descelularización puede llevarse a cabo en la mayoría de los laboratorios. Cabe destacar q…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a John Wirth de los jardines de Olbrich para suministrar amablemente los especímenes utilizados en este proyecto. Este trabajo es apoyado en parte por el National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL115282 para G.R.G.) Fundación de ciencia nacional (DGE1144804 J.R.G y G.R.G.) y el Departamento de cirugía de la Universidad de Wisconsin y el fondo de antiguos alumnos (H.D.L.). Este trabajo también fue apoyado en parte por la Agencia de protección ambiental (grant no. 83573701 de estrella), los institutos nacionales de salud (R01HL093282-01A1 y UH3TR000506) y la National Science Foundation (IGERT DGE1144804).
Materials
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
| Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
| 8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
| Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
| Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
| Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| DMEM | Corning | MT50003PC | |
| Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |
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