여기에 우리가 현재, 및 대비 2 프로토콜 decellularize 식물 조직 하는 데 사용: 세제 기반 접근 및 세제 무료 접근. 두 방법 모두 다음 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 건설 기계로 활용 될 수 있습니다 사용, 식물 조직의 세포 외 매트릭스 뒤에 남겨두고.
헌, 합성, 및 동물 파생 된 이식 조직 교체에 대 한 건설 기계로 현재 사용 되는 낮은 가용성, 불 쌍 한 생체 적합성 및 비용 제한이 있습니다. 식물 조직 그들이 유일 하 게 적합 상호 다공성, 기존 혈관 네트워크, 그리고 다양 한 기계 건설 기계, 높은 표면적, 우수한 물 수송 및 보존, 등으로 사용 하는 유리한 특성이 있다 속성입니다. 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 식물 decellularization의 2 개의 성공적인 방법이 여기 설명 되어 있습니다. 첫 번째 방법은 포유류 조직 취소 하는 데 사용 하는 이전 설립된 방법과 비슷합니다 세포 물질을 제거 하는 세제 목욕을 기반으로 합니다. 두 번째 잎 맥 관 구조를 격리 하 고 온수 표 백제 및 잎과 줄기를 소금 목욕의 사용을 포함 하는 프로토콜에서 적응 하는 세제 무료 방법입니다. 두 방법 모두 유사한 기계적 특성 및 낮은 세포 대사 충격, 따라서 더 나은 그들의 의도 된 응용 프로그램을 적합 한 프로토콜을 선택 하려면 사용자를 허용 건설 기계를 얻을.
조직 생활을 만드는 1980 년대에 등장 하는 조직 공학 대체, 그리고 잠재적으로 주소 중요 한 장기 및 조직 부족1. 한 전략은 자극 하 고 누락 된 조직이 나 장기를 재생성 하기 위해 시체를 안내 건설 기계를 사용 하 고. 첨단 3 차원 인쇄 생산 독특한 물리적 특성으로 건설 기계와 같은 접근을 제조, 비록 달성 물리적 및 생물학적 속성의 다양 한 범위와 건설 기계를 제조 하는 능력 유지 도전2 , 3. 또한, 기능 혈관 네트워크의 부족으로 이러한 기술을 제한 되어 3 차원 조직 재생에. Decellularized 인간과 동물 조직으로 건설 기계를 사용 하 여가 문제4,5,,67우회 주 었 있다. 그러나, 높은 비용, 일괄 배치 변화, 및 제한 된 가용성의 광범위 한 사용을 제한할 수 있습니다 decellularized 동물 투어8. 또한 환자에 게 잠재적인 질병 전송 및 일부 decellularized 포유류 조직9면역학 반응에 대 한 우려가 있다.
셀 루 로스, 식물 및 세균성 소스에서 파생 된 다양 한 응용 프로그램에 대 한 바이오 재생 의학에서 생성 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 몇 가지 예는 다음과 같습니다:10,11, 연골12,,1314 및 상처 치유15뼈. 그들은 내 구성과 저항 포유류 세포에 의해 분해 되 고 하는 룰의 구성 되어 건설 기계 추가 혜택이 있다. 이것이 사실은 포유류 세포는 셀 룰 로스 분자를 분해 하는 데 필요한 효소를 생산 하지 않습니다. 비교에서는, 건설 기계는 세포 외 기질, 콜라겐 등에서 고분자를 사용 하 여, 쉽게16 를 세분화 생산과 장기 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다. 콜라겐 건설 기계 화학 cross-linking에 의해 안정 될 수 있다. 그러나, 건설 기계17의 생체 적합성에 영향을 주는 cross-linkers의 고유한 독성 때문 교환이 이다. 반대로, 셀 루 로스 통하지 포유류 세포18,,1920효소 저하 때문에 시간의 연장된 기간에 대 한 이식의 사이트에 남아 있을 가능성이 있다. 이 가수분해 전처리를 통해 저하의 속도 cellulases21장비의 공동 배달을 조정 하 여 변경할 수 있습니다. Decellularized 플랜트-파생 셀 룰 로스 건설 기계에서 vivo에서 의 생체 적합성도 쥐22연구에서 입증 되었습니다.
진화의 년의 수백만의 수백을 통해 식물의 구조와 구성의 유체 수송 및 유지의 효율성을 증가 하 정제는. 공장 혈관 혈관은 작은 혈관, 머 레이 법23에 따르면 포유류 맥 관 구조에 유사한으로 분기 하 여 유압 저항을 최소화 합니다. Decellularization, 후 식물의 용기 및 상호 연결 된 숨 구멍의 복잡 한 네트워크 유지 됩니다. 쉽게 사용할 수 있는 고유 식물 종의 수많은 고려 건설 기계 공장에서 파생 된 현재 조직 공학24,25건설 기계에 영향을 미치는 디자인 한계를 극복 하기 위해 가능성이 있다. 예를 들어, Modulevsky 그 외 여러분 시연 신생 및 셀 마이그레이션 decellularized 애플 조직 마우스22의 뒤에 피하 이식 했다 때 발생. 마찬가지로, Gershlak 외. 내 피 세포 decellularized 잎24의 맥 관 구조 내에서 성장 될 수 있었다 보여주었다. 별도 실험에서 Gershlak 그 외 여러분 또한 cardiomyocytes 잎의 표면에 성장 수와24계약 수를 보여줄 수 있었다.
식물은 또한 현재까지 개발 된 가장 진보 된 제조 기법으로도 달성 하기 어려운 거시적인 규모에 복잡 한 조직 세포에서 포함 됩니다. 식물 조직의 복잡 한 계층 구조 디자인은 그들이 그들의 성분26의 합계 보다 더 강한 합니다. 식물 줄기 등 견고 하 고 힘든 구성에서 배열 하는 다른 기계적 특성의 과다 보유와 같은 훨씬 더 유연 하 고 유연한 것27를 나뭇잎. 잎 크기 면에서 종에 따라 다릅니다, 그리고 모양, 강도, vascularization, 정도 휴식 및 화란의 다른 학위를가지고 있습니다. 전반적으로, 이러한 식물 속성 decellularized 식물 독특하고 대단히 기능적인 의료 기기, 건설 기계 엔지니어링 조직 등으로 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.
이 프로토콜 decellularize 식물 조직에 두 가지 방법에 초점을 맞추고와 같은 고 조직 공학에서 공중 발판으로 사용 하기 위해 유래한 다. 첫 번째 방법은 DNA와 포유류 decellularize 조직6,22,25 식물에 널리 사용 되는 기술에서 적응 되어 세포 물질을 제거 하는 일련의를 사용 하는 세제 기반 기술 ,,2829,30. 두 번째 방법은 세제 무료 이며 일반적으로 나뭇잎31의 부드러운 조직을 제거 하는 데 사용 하는 “skeletonization” 프로토콜에서 적응 됩니다. 이전 작업 그 주변의 부드러운 조직31는 맥 관 구조 분리를 촉진 표 백제와 나트륨 중 탄산염 해결책에서 잎을 끓인 것을 보여주었다. 이 기술은 17번째 및 18번째 세기 Albertus Seba32 및33에드워드 패 리 쉬 작품 등에서 실시 하는 실험을 다시 인용 될 수 있다. 이러한 실험을 중심으로 잎과 과일, 같은 공장 문제를 떠나 장기간 물에 잠긴 (달 주) 시간과 수 있도록 자연스럽 게 멀리 부패 부드러운 조직. 여기 “skeletonization” 접근은 셀룰러 잔류물을 제거 하 고 부드러운 조직 구조를 크게 방해 하지 않도록 낮은 온도에서 더 이상 보육 시간 등 온화한 조건, 사용에 적응 됩니다. 여기 자세한 실험에 대 한 3 개의 식물 종류 사용 되었다: 무화과나무 hispida, Pachira aquatica 및 필리핀의 종. DNA 정량화, 기계적 테스트, 그리고 두 방법 모두에서 세포 대사 활동에 미치는 영향의 결과 설명 합니다.
여기, decellularize 식물 조직에 두 가지 방법은 설명 합니다. 여기, 결과 나온 프로토콜 가능성이 있다는 제안25, 이전 연구 결과 함께 결합의 광범위에 적용 가능한 종 식물, 줄기와 잎에서 수행할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 공장 decellularization 대부분 실험실에서 실행 될 수 있다 그래서 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 그것은 주목할 만한 그 decellularization, 후에 건설 기?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 기꺼이이 프로젝트에 사용 된 표본 공급 Olbrich 정원의 존 Wirth 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 국립 심장, 폐, 혈액 연구소에 의해 부분에서 지원 (G.R.G.에 R01HL115282) 국립 과학 재단 (J.R.G와 G.R.G.를 DGE1144804), 위스콘신 대학 외과 및 동문 기금 (H.D.L.). 이 작품 또한 일부 환경 보호 기구 (스타 그랜트 no. 83573701)에서 건강의 국가 학회 (R01HL093282-01A1 및 UH3TR000506), 그리고 국립 과학 재단 (IGERT DGE1144804)에 의해 지원 되었다.
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
DMEM | Corning | MT50003PC | |
Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |