To metoder til Decellularization af plantevæv til Tissue Engineering applikationer

Summary

Vi præsenterer her, og kontrast to protokoller bruges til at decellularize plantevæv: et vaskemiddel-baseret tilgang og et vaskemiddel-fri tilgang. Begge metoder efterlader den ekstracellulære matrix af plantevæv bruges, som derefter kan udnyttes som stilladser for væv ingeniørmæssige anvendelser.

Abstract

Autolog, syntetiske og dyr-afledte graftene i øjeblikket bruges som stilladser til væv udskiftning har begrænsninger på grund af lav ledighed, dårlig biokompatibilitet og omkostninger. Plantevæv har gunstige egenskaber, der gør dem enestående egnet til brug som stilladser, såsom høje overfladeareal, fremragende vandtransport og opbevaring, sammenkoblede porøsitet, allerede eksisterende vaskulære netværk, og en bred vifte af mekaniske egenskaber. To vellykkede metoder til plante decellularization af væv ingeniørmæssige anvendelser er beskrevet her. Den første metode er baseret på vaskemiddel bade til at fjerne cellulært materiale, der svarer til tidligere etablerede metoder bruges til at rydde mammale væv. Andet er en vaskemiddel-fri metode tilpasset fra en protokol, der isolerer blad vaskulatur og indebærer anvendelse af en opvarmet blegemiddel og salt bad til at fjerne blade og stængler. Begge metoder giver stilladser med sammenlignelige mekaniske egenskaber og lav cellulære metaboliske virkning, således at brugeren kan vælge den protokol, som passer bedre til deres tilsigtede anvendelse.

Introduction

Vævsmanipulering opstod i 1980 ‘ erne at skabe levende væv erstatninger, og potentielt adresse betydelig orgel og væv mangel på¹. Én strategi har brugt stilladser til at stimulere og styre kroppen til at regenerere mangler væv eller organer. Selv om avanceret fremstilling tilgange, såsom 3D-udskrivning har produceret stilladser med unikke fysiske egenskaber, forbliver muligheden for at fremstille stilladser med en bred vifte af opnåelige fysiske og biologiske egenskaber en challenge^{2 , 3}. Desuden, mangel af en funktionel vaskulære netværk, disse teknikker har været begrænset i regenererende 3-dimensionelle væv. Brugen af decellularized dyrs og menneskers væv som stilladser har hjulpet i at omgå dette problem^4,5,6,7. Høje omkostninger, batch til batch variationer og begrænset tilgængelighed kan imidlertid begrænse udbredt brug af decellularized dyr scaffolds⁸. Der er også bekymring for potentielle smitteoverførsel til patienter og immunologiske reaktion til nogle decellularized mammale væv⁹.

Cellulose, fremstillet af planten og bakteriel kilder, har været flittigt brugt til at generere biomaterialer for en bred vifte af applikationer i regenerativ medicin. Nogle eksempler kan nævnes: ben^10,11, brusk^12,13,14 og sårheling¹⁵. Stilladser, der består af cellulose har en fordel i, at de er holdbare og modstandsdygtige over for at blive opdelt efter pattedyrceller. Dette er at pattedyrceller ikke producerer enzymer nødvendig for at nedbryde cellulose molekyler. I sammenligning, stilladser fremstillet ved hjælp af makromolekyler fra den ekstracellulære matrix, såsom kollagen, nedbrydes let¹⁶ og muligvis ikke velegnet til langsigtede programmer. Kollagen stilladser kan stabiliseres af kemiske cross-linking. Men der er et trade-off på grund af den iboende toksicitet af de cross-linkers, der påvirker biokompatibilitet stilladser¹⁷. Omvendt har cellulose potentiale til at være til stede i stedet for implantation i længere perioder af tid fordi det er uigennemtrængelig for Enzymatisk nedbrydning af pattedyrceller^18,19,20. Dette kan ændres ved tuning sats for nedbrydning ved hydrolyse forbehandling og co levering af stilladser med cellulases²¹. Biokompatibilitet decellularized plante-afledte cellulose stilladser i vivo er også blevet påvist i en undersøgelse udført på mus²².

Gennem hundreder af millioner af års evolution, har planter raffineret deres struktur og sammensætning til at øge effektiviteten af fluid transport og opbevaring. Plante vaskulære fartøjer minimere hydrauliske modstand ved forgrening ind i mindre fartøjer, svarende til pattedyr Vaskulaturen ifølge Murrays lov²³. Efter decellularization bevares plantens komplekse netværk af fartøjer og sammenkoblede porer. I betragtning af det store antal forskellige plantearter lettilgængelige har plante-afledte stilladser potentiale til at overvinde design begrænsninger i øjeblikket påvirker stilladser i tissue engineering^24,25. For eksempel, demonstreret Modulevsky et al. at angiogenese og celle migration opstod decellularized apple væv blev implanteret subkutant på bagsiden af en mus²². Gershlak et al. viste ligeledes, at endotelceller kunne dyrkes i Vaskulaturen af decellularized blade²⁴. I en særskilt eksperiment kunne Gershlak et al. også vise at cardiomyocytes kunne dyrkes på overfladen af bladene og var i stand til at indgå²⁴.

Planter omfatter også kompleks organisation fra cellulære til makroskopisk skala, som er vanskeligt at opnå selv med de mest avancerede fremstillingsteknikker udviklet til dato. Den komplekse hierarkisk design af plantevæv gør dem stærkere end summen af deres vælgere²⁶. Planter i besiddelse af et væld af forskellige mekaniske egenskaber spænder fra stiv og hård komponenter såsom stilke, til meget mere fleksibel og smidig dem som blade²⁷. Bladene varierer afhængigt af arter med hensyn til størrelse, form, bryde styrke, graden af vascularization, og kan bære forskellige grader af hydrofiliciteten. Samlet, disse plante egenskaber tyder på, at decellularized planter kan tjene som unik og yderst funktionelt medicinsk udstyr, herunder som tissue engineering stilladser.

Denne protokol fokuserer på to metoder til at decellularize plantevæv, såsom blade og stilke til anvendelse som stilladser i vævsmanipulering. Den første metode er et vaskemiddel-baseret teknik, der bruger en række bade til at fjerne DNA og cellulære stof, som er blevet tilpasset fra en udbredt teknik til decellularize pattedyr og plante væv^{6,22,25 ,28,29,30}. Den anden metode er vaskemiddel-fri og er tilpasset fra en “skeletonization” protocol almindeligvis anvendes til at fjerne det bløde væv i blade³¹. Forudgående arbejde viste, at ulmende blade i en blegemiddel og natriumbikarbonat løsning lettere adskillelse af Vaskulaturen fra det omgivende bløde væv³¹. Denne teknik kan føres tilbage til forsøg udført i de 17^th og 18^th århundrede, såsom Albertus Seba³² og Edward Parrish³³arbejde. Disse eksperimenter centreret omkring forlader plantemateriale, blade og frugter, neddykket i vandet i længere tid (uger til måneder) og gør det muligt blødere væv til forfald væk naturligt. Her er “skeletonization” tilgang tilpasset til at bruge mildere betingelser, såsom længere inkuberingstider ved lavere temperaturer, at fjerne cellulært rester og undgå væsentligt forstyrre den bløde væv struktur. Til forsøgene detaljeret heri, tre plante typer blev brugt: Ficus hispida, Pachira aquatica og en art af Garcinia. Resultaterne af DNA kvantificering, mekaniske afprøvninger og indvirkning på cellulære metaboliske aktivitet fra begge metoder er beskrevet.

Protocol

1. decellularization af plantevæv brug af vaskemiddel-baseret tilgang Bruge friske eller frosne F. hispida, blad prøver. Fastfryse uudnyttede friske prøver i en-20 ° C fryser og gemme til senere brug (op til et år).Bemærk: Brug stilk eller blad væv af næsten enhver ønskede anlæg. Opbevaring gange kan forårsage skader på væv. Bestemme størrelsen og formen af prøver, der skal behandles på grundlag af den prøve anvendelsesformål (dvs. prøver skære…

Representative Results

Begge metoder givet stilladser, der var egnet til cellekultur og tissue engineering applikationer. Figur 1 viser den generelle arbejdsgang af den decellularization proces ved hjælp af en intakt blad for vaskemiddel-baseret metode og cut prøver (diameter 8 mm) til metoden vaskemiddel-fri. Vellykket decellularization af Ficus hispida væv efter begge metoder givet klart og intakte prøver (figur 1A og 1B…

Discussion

Heri beskrives to metoder til at decellularize plantevæv. Resultaterne præsenteres her, kombineret med resultaterne af tidligere undersøgelser²⁵, tyder på, at protokollerne udrakte sandsynligvis gælder for et bredt spektrum af plantearter og kan udføres på både stængler og blade. Disse procedurer er enkle og kræver ikke specialiseret udstyr, så planten decellularization kan udføres i de fleste laboratorier. Det er bemærkelsesværdigt, at efter decellularization, stilladser skal være …

Materials

Sodium dodecyl sulfate	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)	Clorox	Item #: 31009	Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate	Acros Organics	217120010	Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate	Fisher Scientific		Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker	Any		Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.