ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए संयंत्र के ऊतकों के Decellularization के लिए दो तरीके
Summary
यहां हम मौजूद है, और इसके विपरीत दो प्रोटोकॉल decellularize संयंत्र के ऊतकों के लिए इस्तेमाल किया: एक डिटर्जेंट आधारित दृष्टिकोण और एक डिटर्जेंट मुक्त दृष्टिकोण । दोनों तरीकों संयंत्र के ऊतकों, जो तब ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए पाड़ के रूप में उपयोग किया जा सकता है की extracellular मैट्रिक्स के पीछे छोड़ दें ।
Abstract
ऑटोलॉगस, सिंथेटिक, और पशु वर्तमान में ऊतक प्रतिस्थापन के लिए पाड़ के रूप में इस्तेमाल किया भ्रष्टाचार कम उपलब्धता के कारण सीमाएं हैं, गरीब जैव संगतता, और लागत । संयंत्र के ऊतकों अनुकूल विशेषताएं है कि उंहें विशिष्ट इस तरह के उच्च सतह क्षेत्र, उत्कृष्ट जल परिवहन और प्रतिधारण, परस्पर porosity, मौजूदा संवहनी नेटवर्क, और यांत्रिक की एक विस्तृत श्रृंखला के रूप में मचान के रूप में उपयोग के लिए अनुकूल बनाने के लिए है गुण. ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए संयंत्र decellularization के दो सफल तरीकों यहां वर्णित हैं । पहली विधि डिटर्जेंट स्नान पर आधारित है सेलुलर बात है, जो पहले से स्थापित स्तनधारी ऊतकों को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों के समान है को दूर करने के लिए । दूसरा एक डिटर्जेंट-मुक्त एक प्रोटोकॉल है कि पत्ती vasculature अलग से अनुकूलित विधि है और एक गर्म ब्लीच और नमक स्नान के उपयोग के लिए पत्तियों और उपजी स्पष्ट शामिल है । दोनों तरीकों तुलनीय यांत्रिक गुणों और कम सेलुलर चयापचय प्रभाव के साथ मचान उपज, इस प्रकार उपयोगकर्ता प्रोटोकॉल जो बेहतर उनके इच्छित आवेदन सूट का चयन करने के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
ऊतक इंजीनियरिंग 1980 के दशक में उभरा ऊतक विकल्प रहने वाले बनाने के लिए, और संभवतः महत्वपूर्ण अंग और ऊतक की कमी का पता1। एक रणनीति मचान का इस्तेमाल किया है उत्तेजित और लापता ऊतकों या अंगों को पुनर्जीवित करने के लिए शरीर गाइड । हालांकि ऐसे 3-डी मुद्रण के रूप में उंनत विनिर्माण दृष्टिकोण अद्वितीय भौतिक गुणों के साथ मचान का उत्पादन किया है, को प्राप्त शारीरिक और जैविक गुणों की एक विविध रेंज के साथ पाड़ निर्माण की क्षमता एक चुनौती है2 , 3. इसके अलावा, एक कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क की कमी के कारण, इन तकनीकों 3 आयामी ऊतकों को पुनः उत्पन्न करने में सीमित किया गया है । विपाड़ों के रूप में विसेलुलर पशु और मानव ऊतकों का उपयोग इस समस्या को दरकिनार करने में सहायता प्राप्त है4,5,6,7. हालांकि, उच्च लागत, बैच के लिए बैच परिवर्तनशीलता, और सीमित उपलब्धता के लिए विनिर्मित पशु पाड़ों8के व्यापक उपयोग की सीमा हो सकती है । वहां भी कर रहे है रोगियों और कुछ सेलुलर स्तनधारी ऊतकों को immunologic प्रतिक्रिया के लिए संभावित रोग संचरण के बारे में चिंताएं9।
फाइबर, संयंत्र और बैक्टीरियल स्रोतों से व्युत्पंन, बड़े पैमाने पर अपक्षयी चिकित्सा में आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सामग्री को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । कुछ उदाहरणों में शामिल हैं: हड्डी10,11, उपास्थि12,13,14 और घाव हीलिंग15. पाड़ कि फाइबर के शामिल है कि वे टिकाऊ और स्तनधारी कोशिकाओं से नीचे टूट जा रहा है प्रतिरोधी रहे है में एक अतिरिक्त लाभ है । यह तथ्य यह है कि स्तनधारी कोशिकाओं को नीचे फाइबर अणुओं को तोड़ने के लिए आवश्यक एंजाइमों का उत्पादन नहीं करने के कारण है । इसकी तुलना में, पाड़ों extracellular मैट्रिक्स से अणुओं का उपयोग कर उत्पादित, ऐसे कोलेजन के रूप में, आसानी से नीचे टूट रहे है16 और अच्छी तरह से दीर्घकालिक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है । कोलेजन मचान रासायनिक पार से स्थिर किया जा सकता है जोड़ने । हालांकि, वहां एक व्यापार है पार के अंतर्निहित विषाक्तता के कारण-linkers कि पाड़ों17की अनुकूलता को प्रभावित करते हैं । इसके विपरीत, फाइबर के लिए समय की लंबी अवधि के लिए आरोपण के स्थल पर मौजूद रहने की क्षमता है क्योंकि यह स्तनधारी कोशिकाओं18,19,20द्वारा एंजाइमी क्षरण के लिए अभेद्य है । इस hydrolysis के माध्यम से क्षरण की दर ट्यूनिंग द्वारा बदला जा सकता है और सह cellulases21के साथ पाड़ों के वितरण । vivo में एक सेलुलर संयंत्र व्युत्पंन फाइबर पाड़ के असंगति भी चूहों पर किया22एक अध्ययन में प्रदर्शन किया गया है ।
विकास के वर्षों के लाखों लोगों के सैकड़ों के माध्यम से, पौधों को द्रव परिवहन और प्रतिधारण की दक्षता बढ़ाने के लिए अपनी संरचना और रचना परिष्कृत किया है । संयंत्र संवहनी जहाजों छोटे जहाजों में बंटी द्वारा हाइड्रोलिक प्रतिरोध को कम, स्तनधारी vasculature के लिए इसी तरह के अनुसार है मरे कानून23। decellularization के बाद, संयंत्र के जहाजों के जटिल नेटवर्क और परस्पर pores बनाए रखा है । अलग संयंत्र आसानी से उपलब्ध प्रजातियों की विशाल संख्या को ध्यान में रखते हुए, संयंत्र-पाड़ों को डिजाइन वर्तमान में ऊतक इंजीनियरिंग24,25में पाड़ों को प्रभावित करने की क्षमता पर काबू पाने की संभावना है । उदाहरण के लिए, Modulevsky एट अल. प्रदर्शन किया है कि angiogenesis और सेल प्रवास हुआ जब सेलुलर एप्पल ऊतक एक चूहा22की पीठ पर चमड़े से प्रत्यारोपित की गई । इसी प्रकार, Gershlak एट अल । दिखाया गया है कि endothelial कोशिकाओं के vasculature के भीतर हो सकता है सेलुलर पत्तियों24। एक अलग प्रयोग में, Gershlak एट अल. भी दिखाने के लिए कर रहे थे कि cardiomyocytes पत्तियों की सतह पर उगाया जा सकता है और24अनुबंध करने में सक्षम थे ।
संयंत्र भी सेलुलर से macroscopic पैमाने पर जटिल संगठन है, जो सबसे उंनत विनिर्माण तिथि करने के लिए विकसित तकनीकों के साथ भी प्राप्त करने के लिए मुश्किल है शामिल हैं । संयंत्र के ऊतकों के जटिल पदानुक्रमित डिजाइन उंहें अपने घटक के योग से मजबूत बनाता है26। पौधे ऐसे उपजी के रूप में कठोर और कठिन घटकों से लेकर विभिंन यांत्रिक गुणों के ढेर सारे अधिकारी, इस तरह के रूप में27पत्तियों के रूप में बहुत अधिक लचीला और लचीला वाले । पत्तियां आकार, आकार, तोड़ शक्ति, vascularization की डिग्री के मामले में प्रजातियों के आधार पर बदलती हैं, और hydrophilicity के विभिंन डिग्री ले सकते हैं । कुल मिलाकर, इन पौधों के गुणों का सुझाव है कि सेलुलर संयंत्रों अद्वितीय और उच्च कार्यात्मक ऊतक इंजीनियरिंग पाड़ के रूप में सहित चिकित्सा उपकरणों, के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
इस प्रोटोकॉल ऊतक इंजीनियरिंग में पाड़ के रूप में उपयोग के लिए, इस तरह के पत्ते और उपजी के रूप में संयंत्र के ऊतकों decellularize करने के लिए दो तरीकों पर केंद्रित है । पहली विधि एक डिटर्जेंट आधारित तकनीक है कि स्नान की एक श्रृंखला का उपयोग करता है के लिए डीएनए और सेलुलर बात है, जो एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक से अनुकूलित किया गया है decellularize स्तनधारी और संयंत्र के ऊतकों को दूर है6,22,25 ,28,29,30. दूसरी विधि डिटर्जेंट मुक्त है और एक “skeletonization” आमतौर पर पत्तियों के कोमल ऊतकों को हटाने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल से अनुकूलित है31। पहले काम से पता चला है कि एक ब्लीच और सोडियम बिकारबोनिट समाधान में उबाल पत्तियों आसपास के नरम ऊतक से vasculature की जुदाई की सुविधा31। इस तकनीक को वापस उद्धृत किया जा सकता है प्रयोग 17वें और 18वीं शताब्दियों में किए गए, ऐसे Albertus सबा३२ और एडवर्ड Parrish३३के काम के रूप में । इन प्रयोगों के पत्ते और फल, समय की विस्तारित अवधि के लिए पानी में डूबे के रूप में संयंत्र बात छोड़ने के आसपास केंद्रित है, (सप्ताह के महीनों के लिए) और नरम ऊतकों दूर स्वाभाविक रूप से क्षय की अनुमति । यहाँ “skeletonization” दृष्टिकोण कम तापमान पर अब गर्मी के समय के रूप में मामूली शर्तों, का उपयोग करने के लिए अनुकूलित है, सेलुलर अवशेषों को हटाने के लिए और काफी नरम ऊतक संरचना को बाधित करने से बचने के लिए. इस के साथ साथ विस्तृत प्रयोगों के लिए, तीन संयंत्र प्रकार का उपयोग किया गया: फाइकस hispida, पचीरा एक्वाटिका और Garciniaकी एक प्रजाति. डीएनए ठहराव, यांत्रिक परीक्षण के परिणाम, और दोनों तरीकों से सेलुलर चयापचय गतिविधि पर प्रभाव वर्णित हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ, संयंत्र के ऊतकों को decellularize करने के दो तरीके बताए गए हैं । यहां प्रस्तुत परिणाम, पहले अध्ययन के परिणामों के साथ युग्मित25, सुझाव है कि आगे डाल प्रोटोकॉल प्रजातियों में से एक व्यापक स्?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम कृपा से इस परियोजना में प्रयुक्त नमूनों की आपूर्ति के लिए Olbrich गार्डन के जॉन Wirth शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01HL115282 G.R.G.) द्वारा भाग में समर्थित है नेशनल साइंस फाउंडेशन (DGE1144804 से जे. आर. जी और G.R.G.), और यूनिवर्सिटी ऑफ विस्कॉंसिन सर्जरी एंड भूतपूर्व छात्र कोष (H.D.L.) । यह काम भी पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (स्टार ग्रांट no. ८३५७३७०१), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01HL093282-01A1 और UH3TR000506), और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IGERT DGE1144804) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था ।
Materials
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
| Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
| Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
| Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
| 8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
| Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
| Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
| Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
| Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| DMEM | Corning | MT50003PC | |
| Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |
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