To metoder for Decellularization av anlegget vev for Tissue Engineering programmer

Summary

Her presenterer vi og kontrast to protokoller brukes til å decellularize plante vev: en vaskemiddel tilnærming og et vaskemiddel-fri tilnærming. Begge metodene etterlater den ekstracellulære matrisen av anlegget vev brukes, som deretter kan benyttes som stillaser for tissue engineering programmer.

Abstract

Autologous, syntetiske og animalske graftene brukt som stillaser til vev erstatning har begrensninger på grunn av lav tilgjengelighet, dårlig biocompatibility og kostnader. Anlegget vev har gode egenskaper som gjør dem unikt egnet for bruk som stillaser, som høy areal, utmerket vanntransport og oppbevaring, sammenknyttede porøsitet, eksisterende vaskulære nettverk og en rekke mekaniske egenskaper. To vellykkede metoder for å plante decellularization for tissue engineering programmer er beskrevet her. Den første metoden er basert på vaskemiddel bad fjerne cellulære saken, som ligner på tidligere etablerte metoder brukt for å fjerne pattedyr vev. Andre er et vaskemiddel-fri metode tilpasset fra en protokoll som isolerer blad blodkar og involverer bruk av en oppvarmet blekemiddel og salt bad å fjerne blader og stengler. Begge metodene gir stillaser med sammenlignbare mekaniske egenskaper og lav mobilnettet metabolske innvirkning, slik at brukeren kan velge protokollen som passer bedre deres tiltenkte anvendelse.

Introduction

Tissue engineering dukket opp i 1980 å lage levende vev erstatninger, og potensielt adresse betydelig orgel og vev mangel¹. En strategi har brukt stillaser å stimulere og guide kroppen til å regenerere mangler vev eller organer. Selv om avansert produksjon tilnærminger som 3D utskrift har produsert stillaser med unike fysiske egenskaper, fortsatt evnen til å produsere stillaser med en rekke ulike oppnåelig fysiske og biologiske egenskaper en utfordring^{2 , 3}. videre på grunn av mangel på et funksjonelt vaskulære nettverk, disse teknikkene har blitt begrenset i å regenerere 3-dimensjonale vev. Bruk av decellularized dyr og menneskelige vev som stillaser har hjulpet i omgå dette problemet^4,5,6,7. Men høy pris, parti til parti variasjon og begrenset tilgjengelighet kan begrense utbredt bruk av decellularized dyr stillaser⁸. Det er også bekymringer om potensielle smitteoverføring til pasienter og immunologiske reaksjon på noen decellularized pattedyr vev⁹.

Cellulose, avledet fra plante og bakteriell kilder, har vært mye brukt til å generere biologisk materiale for et bredt spekter av programmer i regenerativ medisin. Eksempler: Ben^10,11, brusk^12,13,14 og¹⁵for sårtilheling. Stillaser som består av cellulose har en ekstra fordel i at de slitesterke og motstandsdyktige mot blir brutt ned av pattedyrceller. Dette er på grunn av at pattedyrceller ikke produserer enzymer som er nødvendig å bryte ned cellulose molekyler. Sammenligning stillaser produsert med makromolekyler fra den ekstracellulære matrisen, som kollagen, brytes lett ned¹⁶ og kan ikke være godt egnet til langsiktige programmer. Kollagen stillaser kan stabiliseres av kjemiske cross-linking. Men er det en avveining på grunn av iboende toksisitet av cross-linkers som påvirker biokompatibilitet av stillaser¹⁷. Omvendt, cellulose har potensial til å være tilstede på stedet av implantasjon lengre tid fordi det er immun mot enzymatisk degradering av pattedyrceller^18,19,20. Dette kan endres ved å justere frekvensen av nedbrytning gjennom hydrolyse forbehandling og co levering av stillasene med cellulases²¹. Biokompatibilitet av decellularized plante-avledet cellulose stillaser i vivo har også blitt vist i en studie gjort på mus²².

Hundrevis av millioner av år med evolusjon, har planter forbedret deres struktur og sammensetning å øke effektiviteten av væske transport og oppbevaring. Fabrikken karsystemet fartøy minimere hydraulisk motstand ved forgreninger inn i mindre fartøyer, lik for pattedyr blodkar ifølge Murrays lov²³. Etter decellularization opprettholdes anlegget komplekst nettverk av fartøy og sammenhengende porene. Tatt i betraktning det store antallet forskjellige plantearter lett tilgjengelig har plante-avledet stillaser potensial til å overvinne design begrensninger for tiden påvirker stillaser i vev engineering^24,25. For eksempel vist Modulevsky et al. at angiogenese og celle migrasjon oppstod når decellularized apple vev ble implantert subcutaneously på baksiden av en mus²². Tilsvarende viste Gershlak et al. at endotelceller kan dyrkes i blodkar decellularized bladene²⁴. I et eget eksperiment kunne Gershlak et al. også viser at cardiomyocytes kunne dyrkes på overflaten av blader og kunne kontrakt²⁴.

Planter også inkludere komplekse organisasjonen mobilnettet til makroskopisk skala, som er vanskelig å oppnå selv med de mest avanserte produksjonsteknikker utviklet ennå. Komplekse hierarkisk utformingen av anlegget vev gjør dem sterkere enn summen av sine bestanddeler²⁶. Planter har en mengde ulike mekaniske egenskaper fra stive og tøff komponenter som stammer, mye mer fleksibel og smidig de som forlater²⁷. Bladene varierer avhengig av Art i størrelse, form, bryte styrke, graden av endometrial blodkar, og kan bære ulike grader av hydrophilicity. Samlet foreslår disse plante egenskapene at decellularized planter kan tjene som unik og svært funksjonell medisinske enheter, inkludert som vev engineering stillaser.

Denne protokollen fokuserer på to metoder for å decellularize plante vev, som forlater og stammer, som stillaser i vev engineering. Den første metoden er en vaskemiddel-basert teknikk som bruker en rekke bad fjerne DNA og mobilnettet matter som har blitt tilpasset fra en brukte teknikk å decellularize pattedyr og plante vev^{6,22,25 ,28,29,30}. Den andre metoden er vaskemiddel uten og er tilpasset fra en “skeletonization”-protokoll som vanligvis brukes til å fjerne bløtvev blader³¹. Tidligere arbeidet viste at simmering blader i en blekemiddel og natriumbikarbonat løsning tilrettelagt separasjon av er blodkar fra de omkringliggende bløtvev³¹. Denne teknikken kan bli sitert tilbake til eksperimenter utført i det 17^th og 18^th århundrer, som Albertus Seba³² og Edward Parrish³³. Disse eksperimentene sentrert rundt slik plantemateriale, som blader og frukt, senkes ned i vann over lengre tid (uker til måneder) og tillater mykere vev forfalt bort naturlig. Her er “skeletonization” tilnærmingen tilpasset for å bruke mildere forhold, for eksempel lengre inkubasjon ganger ved lavere temperaturer, fjerne cellulære rester og unngå betydelig forstyrre bløtvev strukturen. Eksperimenter beskrevet heri, tre anleggstypene ble brukt: Ficus hispida, Pachira aquatica og en art av Garcinia. Resultatene av DNA kvantifisering, mekanisk tester og innvirkning på mobilnettet metabolsk aktivitet fra begge metodene beskrives.

Protocol

1. decellularization av anlegget vev ved hjelp av vaskemiddel-basert tilnærming Bruke friske eller frosne F. hispida, blad prøver. Fryse ubrukte frisk prøver 20 ° C fryser og lagre for fremtidig bruk (inntil et år).Merk: Bruk stammen eller blad vev av nesten alle ønsket anlegget. Utvidet lagringstider kan skade vev. Bestemme størrelsen og form å bli behandlet på grunnlag av prøvens tilsiktet bruk (i.e. prøver skåret i strimler er godt egnet for mekanis…

Representative Results

Begge metodene gitt stillaser som var egnet for cellekultur og tissue engineering programmer. Figur 1 viser den generelle arbeidsflyten av decellularization prosessen med en intakt blad for vaskemiddel-basert metode og kutt prøver (8 mm diameter) for metoden vaskemiddel uten. Vellykket decellularization av Ficus hispida vev etter begge metodene gitt klare og intakt prøver (figur 1A og 1B). Det var muli…

Discussion

Her beskrives to metoder for å decellularize plante vev. Resultatene presenteres her, kombinert med resultatene av tidligere studier²⁵, tyder på at protokollene fremsatt er trolig gjelder for et bredt spekter av plantearter og kan utføres på både stengler og blader. Disse prosedyrene er enkle og krever ikke spesialisert utstyr, slik plante decellularization kan utføres i de fleste laboratorier. Det er bemerkelsesverdig at etter decellularization, stillasene må være functionalized for å le…

Materials

Sodium dodecyl sulfate	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)	Clorox	Item #: 31009	Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate	Acros Organics	217120010	Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate	Fisher Scientific		Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker	Any		Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.